[发明专利]昆虫细胞表达sST2做为测定血清中sST2浓度的校准品

权利要求书

1.一种昆虫细胞表达sST2作为测定血清中sST2浓度的校准品的方法，其特征在于：其步骤是：

a、提取T47D细胞RNA，合成T47D细胞cDNA基因库，用PCR扩增出sST2 DNA，sST2DNA的核酸序列55-987，构建pFastBac-Flag-sST2载体；

b、pFastBac-Flag-sST2载体DNA转导到HD10Bac细菌中，产生重组Flag-sST2AcNPV质粒；

c、重组Flag-sST2 AcNPV质粒DNA转导进到SF9细胞，产生重组Flag-sST2 AcNPV；

d、重组Flag-sST2 AcNPV感染SF9细胞并表达出带有8个氨基酸残基DYKDDDDK、短肽Flag、sST2的19-328氨基酸残基的Flag-sST2蛋白；

e、用Anti-Flag M2亲和琼脂糖纯化出具有蛋白自然结构和抗原性Flag-sST2蛋白；

用Flag-sST2作为校准品，建立双夹心酶联免疫法，测定血清或其它体液中sST2浓度；

上述合成cDNA和PCR扩增sST2 DNA：

(1)合成cDNA用随机引物法

放在0.5ml微量离心管中,混匀；放置在65℃条件下，5分钟，放在冰块中5分钟；

(2)离心后，加下列物质到上述0.5ml微量离心管中

(3)混匀，离心后，放置在50℃条件下，反应10分钟；

(4)放置在80℃条件下，灭活10分钟；

(5)加1ul E.coilRNaseH，37℃条件下，反应20分钟，获得cDNA；

(6)合成引物，引物-1，5’-tttttcatatgaagtttagtaaacaatcatggg-3’

引物-2，5’-tttttctcgagtcagaaacactccttacttggatt-3’；

(7)进行PCR

(8)PCR条件如下：

重复B-D步骤30次

E.95℃ 1分钟30秒

F.56℃ 1分钟30秒

G.72℃ 6分钟

冷却到25℃，完成PCR；

(9)吸取5ul PCR产物，加2ul 5X DNA loading buffer；

(10)放在1％Agarose/TBE凝胶电泳孔中，进行电泳；

(11)用EB进行DNA染色，紫外线下观察934bpDNA条带；

(12)其余PCR产物，加100ul H₂O，再加150ul苯酚、氯仿、异戊醇三者混合液，其中苯酚:氯仿:异戊醇为25:24:1，混合；

(13)离心，13000rpm,5分钟；

(14)收取上清液，加15ul 5M NaCl,800ul乙醇，混合，-20℃，过夜；

(15)4℃条件下,离心，13000rpm,20分钟；

(16)去除上清液，加800ul 70％乙醇，4℃条件下,离心，13000rpm,10分钟；

(17)去除上清液，干燥微量离心管底部DNA，加50ul H₂O溶解DNA；

上述构建FastBac-Flag-sST2质粒：

(1)用NdeI/XhoI内切酶切割DNA

混均，37℃反应2小时；

(2)放在1％Agarose/TBE胶电泳孔中，进行电泳

(3)EB进行DNA染色，紫外线下观察934bp和4.6kb DNA条带，分别切割下DNA条带,分别放到1.5ml微量离心管中

(4)用QIAquick Gel Extraction Kit，提取Agarose条带中DNA

步骤如下：

加700ul BufferQG到含DNA Agarose条带微量离心管中，放在50℃，10分钟，每2分钟震荡一次，溶解Agarose条带

放QIAquick离心柱在2ml收集管中，加上述溶解液700ul到QIAquick离心柱中，放置2分钟

离心，3000g 1分钟,去除收集管中液体

再离心一次，3000g 1分钟

加700ul Buffer PE到QIAquick离心柱

离心，12000g 1分钟,去除收集管中液体

再离心一次，12000g 1分钟，

放QIAquick离心柱在新微量离心管中，室温下，放置5分钟

加30ul H2O到QIAquick离心柱中，室温下，放置3分钟

离心，15000g 1分钟

1.5ml微量离心管收集液中含有DNA，

用Nanodrop Spectrophotometer测定DNA浓度；

(5)用T4DNA ligase，连接PCR DNA片段pFastBac-Flag载体中，

在1.5ml微量离心管中加入以下物质；

混均，25℃，反应4小时；

(6)放微量离心管在冰块上，加100ul感受态细菌，XL10 Gold细菌株，轻轻混合，冰块上放置30分钟

(7)放微量离心管在42℃水浴条件下，50秒，再放到冰块上3分钟

(8)加700ul LB培养液，37℃，摇动1小时

(9)离心，10000g,5分钟，去除上清液，收集微量离心管底部细菌

(10)涂种在100ug/ml Ampicillin LB-琼脂板上，37℃，培养过夜

(11)挑选单个菌落，接种到3ml100ug/ml Ampicillin LB培养液中，37℃，摇动，过夜

(12)提取细菌质粒DNA，用PureLink Quick Plasmid Miniprep Kits

加1.5ml细菌液到微量离心管中，离心，13000rpm3分钟,去除上清液,

加250ul悬浮BufferR3到微量离心管中,均匀悬浮细菌

加250ul溶解BufferL7到微量离心管中,上下倒置微量离心管，放置微量离心管，室温下，5分钟

加350ul沉淀BufferN4到微量离心管中,上下倒置微量离心管，放置微量离心管在冰块中，10分钟

离心，13000rpm，10分钟

放离心柱在2ml收集管中，加上述离心上清液到离心柱中，放置1分钟，离心，12000g，1分钟，去除收集管中液体

加洗涤500ul Buffer W10到离心柱中，放置1分钟，离心，12000g，1分钟，去除收集管中液体

加洗涤700ul Buffer W9到离心柱中，放置1分钟，离心，12000g，1分钟，去除收集管中液体

离心，12000g，1分钟

放离心柱在新微量离心管中，室温下，放置3分钟

加75ul TE buffer到离心柱中，室温下，放置3分钟

离心，12000g 2分钟

1.5ml微量离心管收集液中含有DNA

用Nanodrop Spectrophotometer测定DNA浓度；

(13)PstI内切酶，切割pFastBac-Flag-sST2 DNA

混均，37℃,反应2小时，

(14)放在1％Agarose/TBE胶电泳孔中，进行电泳

(15)EB进行DNA染色，紫外线下观察形成DNA条带；

(16)选出665bp DNA条带质粒DNA，进行DNA序列测定,sST2 DNA测序引物，5’-tttttcatatggggttttggatcttagcaattc-3’；5’-tttttcatatgaagtttagtaaacaatcatggg-3’

(17)选择出正确sST2 DNA序列的pFastBac-Flag-sST2载体。