[发明专利]羊梨形虫检测与鉴别的方法与试剂盒

说明书

本发明公开一种用于非疾病诊断的检测与鉴别羊梨形虫及其种类的方法与试剂盒。本发明的检测与鉴别方法是：提取待检测羊的血液基因组DNA得到待测样本，在反应体系内加入饱和染料再用引物SEQ ID No.1和SEQ ID No.2对重组质粒和待测样本进行PCR扩增，再进行高分辨率熔解曲线分析，根据有无扩增产物确定待测样品有无感染羊梨形虫，根据扩增产物熔解曲线与重组质粒的熔解曲线重合情况确定所感染的羊梨形虫的种类。本发明的方法可检测国内现存所有的病原，检测结果良好，而且可同时进行5种梨形虫病原的鉴别检测，适合在动物体内快速检测梨形虫。

技术领域

本发明涉及一种用于非疾病诊断的检测与鉴别羊梨形虫及其种类的方法与 试剂盒。

背景技术

羊梨形虫病是由媒介蜱传播的一类血液原虫病，是由梨形虫亚纲中的泰勒 虫科和巴贝斯虫科的原虫寄生于羊的淋巴细胞和红细胞内所引起的疾病，包括 泰勒虫病和巴贝斯虫病。目前，全世界已报道的羊的泰勒虫有6种：莱氏泰勒 虫(T.lestoquardi)、绵羊泰勒虫(T.ovis)、分离泰勒虫(T.separata)、隐藏泰勒 虫(T.recondita)、尤氏泰勒虫(T.luwenshuni)和吕氏泰勒虫(T.uilenbergi)。 已经报道的感染羊的巴贝斯虫病病原有5种，即莫氏巴贝斯虫(B.motasi)、绵羊 巴贝斯虫(B.ovis)、粗糙巴贝斯虫(B.crassa)、叶状巴贝斯虫(B.foliata) 和泰氏巴贝斯虫(B.taylori)。在我国，感染羊的泰勒虫有三个种，即吕氏泰勒 虫、尤氏泰勒虫和绵羊泰勒虫。我国广泛流行的巴贝斯虫可分为两个种群，即莫氏巴贝斯虫(B.motasi)和巴贝斯虫未定种种群(Babesia sp.)。其中羊巴贝斯 虫临潭株、羊巴贝斯虫天祝株、羊巴贝斯虫河北株和羊巴贝斯虫宁县株属于莫 氏巴贝斯虫种群；而羊巴贝斯虫新疆株和羊巴贝斯虫敦煌株属于巴贝斯虫未定 种。利用ITS、HSP90、COI、COB、COX3、RPS8和TRAP基因对我国的巴贝 斯虫分离株进行分类研究表明，莫氏巴贝斯虫被分成两个小分支，即河北株/宁 县株(莫氏巴贝斯虫NB亚种)和临潭株/天祝株(莫氏巴贝斯虫LZ亚种)。羊 的梨形虫病在我国广泛流行，造成了巨大的经济损失，对我国养羊业的健康持 续发展造成了巨大的威胁。马米玲等利用酶联免疫吸附试验对我国5省13县进 行羊泰勒虫病调查显示，部分地区泰勒虫感染率高达93.8％。李有全等利用PCR

目前用于泰勒虫和巴贝斯虫感染早期鉴别诊断的方法主要有血涂片染色 法，该方法在染虫率很低的情况下很难检查出病原。分子生物学方法，如聚合 酶链式反应(PCR)、实时荧光定量PCR(Real-time PCR)、反向线状印迹(RLB)、 环介导等温扩增(LAMP)、限制性内切酶片段多态性(RFLP)、DNA探针技 术等，不能同时实现多种病原的鉴别诊断，而且操作繁琐，容易引物交叉污染 而出现假阳性。

发明内容

本发明提供一种可克服现有技术不足的、用于非疾病诊断的检测与鉴别羊 梨形虫及其种类的方法，本发明同时公开一种非疾病诊断的检测与鉴别羊梨形 虫及其种类的试剂盒。

本发明的羊梨形虫非疾病诊断的检测与鉴别方法是：构建羊巴贝斯虫未定 种、莫氏巴贝斯虫HB亚种、莫氏巴贝斯虫LT亚种、吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫 18sRNA重组质粒，提取待检测羊的血液基因组DNA得到待测样本，在反应体 系内加入饱和染料再用引物SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2对重组质粒和待测样本 进行PCR扩增，再进行高分辨率熔解曲线分析，根据有无扩增产物确定待测样 品有无感染羊梨形虫，根据扩增产物熔解曲线与重组质粒的熔解曲线重合情况 确定所感染的羊梨形虫的种类。

本发明的羊梨形虫非疾病诊断的检测与鉴别方法中所用的饱和染料为 Forget-Me-Not^TM qPCRMasterMix。

优选地，本发明的羊梨形虫非疾病诊断的检测与鉴别方法在PCR扩增时的 反应体系为：