[发明专利]Luc-GFP标记的高转移性人肝癌细胞株及其在原位肝癌模型中的应用

说明书

本发明公开了一种Luc‑GFP标记的高转移性人肝癌细胞株，是以肝癌细胞为母细胞，通过慢病毒转染包装有pCDH‑CMV‑Luc‑EF1‑GFP‑Puro的病毒液，再经嘌呤霉素筛选，获得稳定表达GFP并具有荧光素酶活性的高转移性人肝癌细胞株。利用本发明Luc‑GFP标记的高转移性人肝癌细胞，通过细胞悬液法和肿瘤组织块转接法分别建立裸鼠原位肝癌模型，其肝癌模型成瘤率均为100%，肺转移率分别100%和80%，为活体动物水平监控肿瘤的生长、评价抗肝癌转移药物的疗效奠定基础，具有较大的应用前景。

技术领域

本发明属于生物医学领域，更具体地，涉及一种Luc-GFP标记的高转移性人肝癌细胞系及其在原位肝癌模型中的应用。

背景技术

原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC，简称肝癌)是全球发病率占第六位、死亡率占第三位的恶性肿瘤。我国是肝癌的高发国，每年新发肝癌约35万例，每年死于肝癌的人数约32万人，已上升至城市和农村恶性肿瘤病死率的第二和第一位。肝癌侵袭转移与复发是患者死亡的主要原因之一。因此，探索肝癌侵袭转移与复发的机制，寻求有效抑制肝癌转移与复发的药物具有重要意义，而建立自发转移且观察方便的人肝癌裸鼠模型是研究人肝癌的复发与转移规律、评价抗肝癌药物疗效的基础。复旦大学肝癌研究所已建立了高转移人肝癌细胞系MHCC97H、HCCLM3以及高转移人肝细胞癌裸鼠模型等、为肝癌治疗、转移复发研究提供了有效的手段，但这些模型不能连续、直观地观察原位肿瘤及肺和腹腔转移灶，定量也不够准确。

活体成像技术利用一套非常灵敏的光学检测仪器，让研究人员能够直接监控活体生物体内的细胞活动和基因行为，已广泛应用于生命科学、医学研究及药物开发等方面。活体成像技术主要采用荧光(fluorescence)与生物发光(bioluminescence)两种技术。荧光发光采用荧光报告基团(GFP、RFP、Cyt及dyes等)进行标记，需要激发光使得荧光基团达到较高的能量水平，然后发射出较长波长的发射光，但是生物体内很多物质在受到激发光激发后，也会发出荧光，产生的非特异性荧光。荧光发光不需要底物，费用低廉，操作简单。生物发光是将荧光素酶(Luciferase)基因整合到细胞染色体DNA上以表达荧光素酶，在ATP及氧气存在时，外源(腹腔或静脉注射)给予底物荧光素(Fluorescein)，荧光素酶催化荧光素的氧化反应产生发光。作为体内报告源，生物发光在动物体自身不会发光，具有极低的背景。

申请公布号为CN102399748A的专利公开了一种表达绿色荧光蛋白和荧光素酶胃癌细胞株，通过将多种慢病毒包装质粒pWPT-GFP，pMD2.G，pSPAX2，pLenti-CMV-puro-LUC，VSVg和pCMV-dR8.91按照一定比例用脂质体法转染293T细胞，经过两次转染，获得含有绿色荧光蛋白和萤火虫荧光素酶慢病毒颗粒，再以人胃癌细胞系为母细胞，用上述病毒感染，获得稳定表达绿色荧光蛋白和荧光素酶的阳性克隆；所述方法需要用到多种慢病毒包装质粒，且各个质粒需要按照一定比例要求，需要经过两次转染，不仅步骤繁琐，费时费力，而且转染效率不高，有一定的局限性。同时，转染载体的构建也影响着转染结果，病毒载体对特定宿主细胞感染效率较高，但不同病毒载体有其特定的宿主，有的还要求特定的细胞周期，如逆转录病毒需侵染分裂期的宿主细胞，此外还需考虑一些安全问题(如基因污染)。除载体构建外，载体的形态及大小对转染效率也有不同的影响。如果基因产物对细胞有毒性作用，转染也很难进行，因此选择组成或可调控，强度合适的启动子也很重要。

目前还没有见有成功构建稳定表达荧光素酶(Luc)和绿色荧光蛋白(GFP)的人肝癌细胞株的报道。

发明内容