[发明专利]猪流行性腹泻病毒的实时荧光RT-PCR检测方法及试剂盒

说明书

本发明公开了一种用于检测猪流行性腹泻病毒的实时荧光RT‑PCR引物和探针及试剂盒，所述PCR引物的上下游引物序列依次如SEQ ID NO:1～2所示，探针序列如SEQ ID NO:3所示；本发明方法能特异检测PEDV病毒，与TGEV、RV等其他14种常见猪病原、猪基因组核酸以及传代细胞核酸均无交叉反应；检测低限可达0.39copy/μL克隆基因拷贝或2fg/μL病毒核酸，且重复性非常好。对119份猪临床样品的检测试验显示，本发明荧光RT‑PCR方法临床检测高效可靠；采用135份样品进行的方法准确性评估试验结果显示，该法检测真阳性率为100%，真阴性率为100%，说明本发明方法准确可靠，具有较大的应用前景。

技术领域

本发明属于动物疾病检测技术领域，更具体地，涉及一种猪流行性腹泻病毒的实时荧光RT-PCR检测方法及试剂盒。

背景技术

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由套式病毒目冠状病毒科、冠状病毒属的猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一种猪肠道传染病，以水样腹泻、呕吐和脱水为特征。各种日龄的猪均可感染，哺乳仔猪、断奶仔猪的发病率可达100％，尤其哺乳仔猪受害最为严重，此病多发生于寒冷季节。20世纪70年代最初发现于英国。随后，许多国家如比利时、德国、加拿大、法国、日本等国也都出现了PED流行的报道，我国从20世纪80年代初开始陆续有本病的流行报道，并且给我国的养猪业带来了巨大的损失。

猪流行性腹泻病毒(PEDV)属于I类冠状病毒。PEDV是一个正向包膜病毒，其基因组是正义单链RNA 5'端有帽结构(cap)，3'端有Poly(A)尾，基因组全长为28033bp。基因组5'端非翻译区(5'UTR)位于基因1上游，长296nt；5'UTR内含有长为65nt～98nt的前导序列(L)和1个以AUG为起始密码子并拥有Kozak序列(GUUCaugC)和编码12个氨基酸的开放阅读框(ORF)；基因组3'端非翻译区(3'UTR)长度为334nt，末端连有Poly(A)序列。3'UTR内含有由8个碱基(GGAAGAGC)组成的保守序列起始于poly(A)上游的73nt处。剩余基因组序列包括6个ORF，从5'～3'端依次为编码复制酶多聚蛋白1ab(pp1ab)、纤突蛋白(S)、ORF3蛋白、小膜蛋白(E)、膜糖蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)的基因。复制酶多聚蛋白基因(基因1)占全基因组2/3，长20346nt，包括ORF1a(12354nt)和ORF1b(8037nt)两个开放阅读框，二者之间有46nt的重叠序列，重叠处有滑动序列(UUUAAAC)和假结结构，它们能使核糖体进行移码阅读，从而保证基因1的正确翻译。S基因、E基因、M基因和N基因分别编码病毒的结构蛋白，长度分别为4152，231，681nt和1326nt。ORF3基因长675nt，编码非结构蛋白，在每两个相邻基因之间有基因间隔序列(IS)，它与基因组和亚基因组mRNA的L序列3'端有7nt～18nt相同，在病毒基因组复制和翻译过程中发挥重要作用。

目前针对PEDV的实验室诊断方法有病原学方法、基于病毒抗原或抗体的免疫学方法和针对病毒RNA核酸检测技术。传统的病原学方法主要通过细胞进行病毒的分离，耗时、耗力。用免疫学检测抗体可以了解病毒感染以及疾病发生、发展的过程，然而，由于抗体只有在病毒感染至一定时期后才会出现，因此抗体检测在作为快速防控的方法时存在一定局限性。荧光定量PCR以特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快的诸多优点成为分子生物学研究中的重要工具。

申请号为CN201310511288.4、CN201410146551.9、CN201310217682.7、CN201710200348.9、CN201610626179.0和CN201610088587.5的专利均公开了猪流行性腹泻病毒的荧光定量PCR引物、方法或试剂盒，但均存在着检测灵敏度不高等问题，无法适用于临产复杂多变的检测需求。

发明内容