[发明专利]猪流行性腹泻病毒的实时荧光RT-PCR检测方法及试剂盒在审
| 申请号： | 201711353125.2 | 申请日： | 2017-12-15 |
| 公开（公告）号： | CN108441579A | 公开（公告）日： | 2018-08-24 |
| 发明（设计）人： | 艾青;杨健 | 申请（专利权）人： | 广州市瑞品生物技术有限公司 |
| 主分类号： | C12Q1/70 | 分类号： | C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11 |
| 代理公司： | 广州粤高专利商标代理有限公司 44102 | 代理人： | 陈卫 |
| 地址： | 511430 广东省广州市番禺区大*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 检测 猪流行性腹泻病毒 试剂盒 核酸 实时荧光RT-PCR 病原 准确性评估 病毒核酸 传代细胞 高效可靠 检测低限 交叉反应 克隆基因 临床检测 临床样品 实时荧光 探针序列 引物序列 猪基因组 真阳性 真阴性 荧光 拷贝 探针 病毒 试验 应用 | ||
1.一种用于检测猪流行性腹泻病毒的荧光RT-PCR引物和探针，其特征在于，所述PCR引物的上下游引物序列依次如SEQ ID NO:1～2所示，探针序列如SEQ ID NO:3所示，探针5’端标记荧光基团、3’端标记淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的荧光RT-PCR引物和探针，其特征在于，所述荧光基团为FAM，所述淬灭基团为BHQ1。
3.权利要求1或2所述荧光RT-PCR引物和探针在猪流行性腹泻病毒检测中和/或在制备猪流行性腹泻病毒检测试剂盒中的应用。
4.一种猪流行性腹泻病毒的荧光RT-PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.提取待测样本RNA；
S2.以S1所述RNA为模板，用权利要求1所述荧光RT-PCR引物和探针进行荧光定量PCR扩增反应；
S3.结果判断：样品检测结果Ct≤35.0且扩增曲线有明显的对数增长期，判为荧光RT-PCR阳性反应；检测结果样品呈现无Ct值或Ct值为40.0、无扩增曲线或反应曲线无明显对数增长期，判为荧光RT-PCR阴性反应；对于35＜Ct＜40.0的样品，重新取样进行重复检测；重复检测样品Ct＜40.0且扩增曲线有明显的对数增长期，判定为荧光RT-PCR阳性反应，否则判为荧光RT-PCR阴性反应。
5. 根据权利要求4所述的猪流行性腹泻病毒的荧光RT-PCR检测方法，其特征在于，25µLPCR反应的体系为：10mmol/L Tris-HCL（PH8.8），50mmol/L KCL，3mmol/L MgCL2，0.2mmol/L dNTP，0.1mg/mL BSA，上、下游引物各0.2µmol/L，探针0.12 µmol/L，4%甘油，1U Taq DNA聚合酶，50U M-MLV逆转录酶，5～10µL模板。
6.根据权利要求4所述的猪流行性腹泻病毒的荧光RT-PCR检测方法，其特征在于，所述荧光RT-PCR反应的条件为：42℃反转录15min，95℃预变性3min；95℃变性10s，60℃退火40s，40个循环，60℃设置采集荧光。
7.一种猪流行性腹泻病毒检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的荧光RT-PCR引物和探针。
8.根据权利要求7所述的猪流行性腹泻病毒检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含反转录反应所需试剂，荧光定量PCR所需试剂，DEPC处理水，阳性对照和阴性对照。
9.根据权利要求8所述的检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为含有PEDVM2基因片段的T载体克隆，阴性对照为DEPC处理水。
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