[发明专利]一种作用于烧伤泛耐药鲍曼不动杆菌感染治疗中的噬菌体的应用方法

权利要求书

1.一种作用于烧伤泛耐药鲍曼不动杆菌感染治疗中的噬菌体的应用方法，其特征在于：包括以下步骤；

步骤一:针对国内烧伤感染鲍曼不动杆菌感染的流行病学调查，收集流行菌株的步骤；

步骤二：对步骤一收集到的泛耐药鲍曼不动杆菌进行MLST分型；

步骤三：针对步骤二分离每种MLST型别鲍曼不动杆菌的噬菌体,构建泛耐药鲍曼不动杆菌的噬菌体库的步骤；

步骤四:采用动物实验验证所构建噬菌体库对泛耐药鲍曼不动杆菌感染的治疗效果的步骤。

2.根据权利要求1所述作用于烧伤泛耐药鲍曼不动杆菌感染治疗中的噬菌体的应用方法，其特征在于：所述步骤一当中，包括对国内十五家烧伤病房的鲍曼不动杆菌感染情况进行调查,收集目前正在烧伤病房流行的鲍曼不动杆菌,然后结合生化的方法(VITEKGNI+cards)和分子生物学的方法(16SrRNA基因测序和OXA-51基因检测)，验证每一株细菌是否为鲍曼不动杆菌,根据药敏实验结果，结合泛耐药鲍曼不动杆菌的定义，筛选出泛耐药鲍曼不动杆菌菌株。

3.根据权利要求1所述的作用于烧伤泛耐药鲍曼不动杆菌感染治疗中的噬菌体的应用方法，其特征在于：在步骤二中，应用MLST对所调查的泛耐药鲍曼不动杆菌进行分型，收集每个MLST型别细菌1-5株：根据Pubmed公布的鲍曼不动杆菌的MLST分型方法，合成引物测序后比对分型，研究不同MLST分型的分布和流行情况；根据每个MLST型别所占比例不同，每个MLST型别细菌收集1-5株。

4.根据权利要求1所述的作用于烧伤泛耐药鲍曼不动杆菌感染治疗中的噬菌体的应用方法，其特征在于：所述步骤三中，包括以步骤一收集的不同MLST型别鲍曼不动杆菌为宿主菌，采用实验室前期建立的快速分离噬菌体的双层琼脂法，大量分离噬菌体，每个MLST型别细菌至少分离5株噬菌体，并检测每一株噬菌体的裂菌谱,然后纯化上一步得到的每一株噬菌体，根据其裂菌谱情况，将不同MLST型别鲍曼不动杆菌的噬菌体等比例混合在PBS缓冲液中，构建噬菌体库,最后用第一部分流行病学调查的所有菌株，检测所构建的噬菌体库的裂菌谱,若裂菌谱小于90％，则返回继续扩大分离噬菌体，增加噬菌体库的成分，直至构建噬菌体库达到90％。

5.根据权利要求1所述的作用于烧伤泛耐药鲍曼不动杆菌感染治疗中的噬菌体的应用方法，其特征在于：所述步骤四中，还包括如下步骤:

(1)评估所构建的噬菌体库对局部皮肤鲍曼不动杆菌感染的治疗效果：

A.建立小鼠局部皮肤鲍曼不动杆菌感染模型，参考Mircea等人的方法，以BALB/c小鼠为模型，在小鼠背侧剃毛后打孔，制作皮肤缺损模型，再将5×107CFU的鲍曼不动杆菌滴在皮肤缺损处，建立局部感染模型；

B.每只老鼠三个皮损孔分别设置抗生素治疗组、噬菌体库治疗组和空白组，抗生素组创面每日予以复方多粘菌素B软膏涂抹一次，噬菌体组每日予以噬菌体制剂湿敷一次，空白组无仸何处理。同样的方法连续治疗3天，每天一次；

C.连续观察4周，记录小鼠的一般生命状况，创面愈合情况和创周感染情况，根据创面愈合情况、全身反应等情况比较三组的治疗效果；

(2)评估所构建的噬菌体库对鲍曼不动杆菌脓毒血症的治疗效果：

A.首先建立小鼠鲍曼不动杆菌脓毒血症模型，将培养至生长期的鲍曼不动杆菌重悬于PBS中，叏0.5ml细菌悬液通过尾静脉注射至小鼠体内；

B.实验分三组，设置空白对照组、抗生素治疗组和噬菌体库治疗组三组,抗生素组给予50mg/kg的泰能静脉注射治疗，噬菌体组注射等体积的噬菌体治疗，空白对照组注射等体积的PBS溶液，同样的方法连续治疗7天，每天一次；

C.连续观察4周，根据小鼠一般生命状况、生存率及全身反应等情况比较三组的治疗效果；

(3)评估不同给药途径下，构建的噬菌体库对小鼠安全性研究:

A.局部外用所构建噬菌体库对小鼠安全性研究：以BALB/c小鼠为模型，每日给予外用噬菌体库5ml(冲洗局部皮肤两次，连续给药1周，检测对一般生命状况的影响，对免疫系统的影响，对小鼠寿命的影响；

B.口服所构建噬菌体库对小鼠安全性研究：以BALB/c小鼠为模型，每日给予口服噬菌体库5ml两次，连续给药1周，检测对一般生命状况的影响，对免疫系统的影响，对小鼠寿命的影响；

C.静脉注射所构建噬菌体库对小鼠安全性研究：以BALB/c小鼠为模型，每日给予静脉注射噬菌体库5ml两次，连续给药1周，检测对一般生命状况的影响，对免疫系统的影响，对小鼠寿命的影响；

(4)通过临床试验，进行烧伤病人感染实验:

A.向本地区伦理委员会申请批准临床试验，通过申请临床试验后联系医院协调进行临床试验，确定该治疗方案的安全性及有效性；

B.本院临床试验通过后，开展学术会议，联系全国主要医院，进行多中心临床试验。