[发明专利]一种组织工程角膜

说明书

技术领域

本发明属于组织工程技术领域，具体涉及一种组织工程角膜。

背景技术

人角膜基质由紧密排列的胶原纤维薄片组成，具有透明度高，机械韧性好的特性，在体外难以达到，因此使得体外组织工程角膜面临巨大挑战。全球约有2.85亿人视力受损，其中3900万人盲，角膜疾病则是次于白内障导致失明的第二大原因。同时据报道，儿童失明原因中大概有20％是角膜疾病引起。目前当其他治疗方法失败后，角膜移植是角膜疾病最有效和最常见的治疗方法，但由于高质量角膜供体的短缺、角膜移植术后出现的排斥反应、逐年增加的移植术后的失败率等，都使得这个最佳治疗方法受到限制。

角膜基质细胞主要合成胶原分子和蛋白聚糖、维持角膜基质结缔组织缓慢的代谢。由于角膜基质其胶原组织高度有序的排列结构和体外角膜基质细胞的不稳定性，使得体外组织工程角膜与预期结果相差甚远。目前已经证实，体外培养的角膜基质细胞很容易就分化为成纤维细胞，并进一步分化为纤维母细胞，导致角膜基质细胞特异性蛋白如角蛋白聚糖，CD34和CHST6表达降低。纤维母细胞则会分泌排列不规则、具有瘢痕特点的细胞外基质组织。因此，如何在体外最大限度地保持基质细胞表型，是组织工程角膜需探讨的关键问题之一。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种组织工程角膜。

本发明的另一目的在于提供上述组织工程角膜的制备方法。

本发明的技术方案如下：

一种组织工程角膜，包括至少三羊膜组织层，相邻的二羊膜组织层间生长有角膜基质细胞，并含有由上述角膜基质细胞分泌的包含角蛋白聚糖、光蛋白聚糖、I型胶原蛋白和V型胶原蛋白的细胞外基质，且上述细胞外基质排列规则，形成类似于角膜基质的组织结构，上述羊膜组织层的表面的胶原纤维排列规则，纤维之间相互平行，具有沟槽结构，并以正相交紧密排列成纤维薄片，以引导角膜基质细胞及其分泌的细胞外基质规则排列，上述至少三羊膜组织层具有抑制纤维化的特性以保持角膜基质细胞的特性并抑制角膜基质细胞向成纤维细胞分化。

在本发明的一个优选实施方案中，所述角膜基质细胞由接种于所述至少三羊膜组织层之间的干细胞分化而成，该干细胞包括角膜基质干细胞、间充质干细胞、神经嵴来源的干细胞和胚胎干细胞。

在本发明的一个优选实施方案中，所述羊膜组织层为全层羊膜或经蛋白酶消化处理去除海绵层及网状层后保留的致密层。

在本发明的一个优选实施方案中，所述至少三羊膜组织层的最上层的羊膜组织层的上表面接种并生长有角膜上皮细胞。

进一步优选的，所述角膜上皮细胞来源于原代培养的角膜上皮细胞、传代培养的角膜上皮细胞、角膜上皮细胞系或干细胞分化而来的角膜上皮替代细胞。

在本发明的一个优选实施方案中，所述至少三羊膜组织层的最下层的羊膜组织层的下表面接种并生长有角膜内皮细胞。

进一步优选的，所述角膜内皮细胞来源于原代培养的角膜内皮细胞、传代培养的角膜内皮细胞、角膜内皮细胞系或干细胞分化而来的角膜内皮替代细胞

在本发明的一个优选实施方案中，其培养环境的氧含量为5～15％。

在本发明的一个优选实施方案中，其所用的培养基为包括非必需氨基酸、成纤维细胞生长因子2和转化生长因子β3的有血清培养基或无血清培养基。

本发明的有益效果是：

1、本发明在特定环境下培养角膜基质细胞(羊膜表面的胶原纤维排列规则，纤维之间相互平行、有沟槽结构，引导角膜基质细胞及细胞分泌的胶原规则排列；羊膜的胶原排列与人角膜基质非常相似，即胶原纤维间以正相交紧密排列成纤维薄片，角膜基质样组织形成过程中能够作为模板来引导分泌胶原排列与重塑；羊膜抑制纤维化的特性，体外可以很好地保持角膜基质细胞特性，抑制其向成纤维细胞分化)，上述角膜基质细胞分泌产生细胞外基质，这些细胞外基质排列高度规则、胶原纤维呈正相交排列成多层纤维薄片，形成类似于角膜基质的组织结构。

2、本发明由至少三羊膜组织层叠加构成胶合板结构，模拟了角膜基质的多层纤维薄板结构，同时大大提高了组织工程角膜的厚度和机械韧性。

3、本发明的组织工程角膜可应用于角膜组织发育研究，角膜药物研究以及角膜病变的替代治疗。

附图说明

图1为本发明的组织工程角膜的制备原理图。

图2为本发明的角膜基质细胞在羊膜表面和细胞培养皿中的形态和排列图。

图3为本发明的角膜基质细胞在羊膜表面和细胞培养皿中的mRNA和蛋白表达量结果图。

图4为本发明中的不同层数羊膜的光透明度图。