[发明专利]氨解方法及氨解组合物

说明书

本申请提供了一种用于在DNA固相合成后进行氨解的方法，包括以下步骤：1)向包括用于合成DNA片段的固相载体的合成柱内加入氨解组合物；2)将所述合成柱置于装有氨解缓冲液的可密封容器内，并保持所述合成柱位于所述氨解缓冲液的液面上方；以及3)以微波处理所述可密封容器，使得所述固相载体处于所述氨解缓冲液的蒸汽气氛中；4)取出所述合成柱，以洗脱液处理所述固相载体并收集流出液。本发明还提供了用于氨解的氨解组合物。本发明提供的氨解方法仅需使用较少量的氨解试剂，可避免交叉污染，缩短了反应时间，方便清洗溶剂清洗，并且无需高压设备，有利于工业化和自动化使用。

技术领域

本发明涉及生物工程领域，尤其是与DNA固相合成相关的氨解方法。本发明还涉及用于氨解的氨解组合物。

背景技术

DNA合成(尤其是DNA引物合成)是大多是基于固相合成技术，通过脱保护、缩合、氧化以及盖帽四个步骤的循环，将亚磷酰胺单体按3’端到5’端的顺序逐个连接至控制孔径玻璃球(CPG)表面。每个亚磷酰胺单体的5’端羟基由二甲氧基三苯基(DMT)基团保护，其碱基上的活性氨基分别由乙酰基(Ac)、苯甲酰基(Bz)、二氮甲基甲脒基(dmf)等基团保护。其中DMT基团为酸不稳定的，可在3％三氯乙酸的二氯甲烷等溶液中被切除，Ac、Bz、dmf等基团为碱不稳定基团，可在饱和氨水等溶液中被切除。

合成的具体步骤为：

a)使用三氯乙酸溶液将CPG表面的DMT基团切除，露出自由羟基；

b)以四氮唑为活化剂，使亚磷酰胺单体活化的3’端磷酸基团与CPG表面的亚磷酰胺单体的5’端羟基缩合，形成磷酸二酯键；

c)使用碘溶液作为氧化剂，将引物骨架中不稳定的三价磷氧化成稳定的五价磷；

d)使用乙酸酐与氮甲基咪唑作为盖帽试剂，将步骤b)中未参与反应的自由羟基乙酰化；

e)重复以上a)至d)步骤直至序列合成结束，并脱去最后一个DMT基团。

待合成结束后，将CPG粉末浸泡在饱和氨水溶液中并放置在55℃进行氨解反应。该过程主要包含三步反应：i)将引物从CPG上切除；ii)将各碱基上的氨基保护基团切除；iii)将3’端的磷酸基团切除。在合成时，若3’端需进行磷酸化修饰，可以通过选择不同类型的CPG而对iii)步骤进行选择性省略。

使用饱和氨水进行氨解时，通常需要在55℃反应16小时，或在65℃反应8小时。使用饱和氨水与甲胺水溶液的1:1混合液(AMA)作为氨解试剂，可以将反应时间可以缩短至15分钟左右。但由于上述氨解方式需将CPG粉末浸没在氨解溶液中而容易引起交叉污染，且在氨解之后需要花2小时左右将溶液抽干，故在引物的大规模工业生产应用中存在一定困难。

现有的微波氨解方式可将氨解反应时间降低至1小时左右。该微波氨解方式需将CPG粉末浸泡于氢氧化钠的水和甲醇混合液中，在微波条件下进行反应。由于温度升高可能导致溶液爆沸，故需要每隔6-10秒便将反应管取出置于冰水中冷却1-2秒，待反应结束后再将溶液抽干得到最终的产物。该方法存在以下缺点：I)氨解试剂在过程中容易挥发而造成可重复性较差；II)反复冷却，操作过于繁琐，整体耗时较长；III)反应结束后引物无法进行清洗，且抽干水和甲醇混合液耗时较长；IV)当使用96孔板或384孔板进行大规模引物合成时，兼容性较差，容易产生交叉污染。

即使二代引物合成柱使用CPG与基质制成的熔块(即CPG Frits)代替CPG粉末作为固相载体，通过提升合成过程中的试剂渗透性而提升了引物合成质量，但该类合成柱中的固相载体在氨解时较难取出而浸没于氨解试剂中，也降低了微波氨解的工业化可行性。

使用气相氨解的方式可显著降低交叉污染的可能。该氨解方式需将引物合成柱放置在高压容器中，使用气体氨气为氨解试剂，在高压(约140psi)下反应30分钟左右。虽然该方法后处理环节较为简单，但是该氨解方式对于设备的需求较高。

发明内容