[发明专利]一种I群4型腺病毒长效卵黄抗体制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及兽用生物制品技术领域，具体涉及一种I群4型腺病毒长效卵黄抗体制备方法。

背景技术

鸡心包积液和肝炎综合征是由禽I群4型腺病毒引起鸡的一种急性传染病，该病多发于3～6周龄的肉鸡，也可偶发于20周龄内的后备蛋鸡或种鸡，无性别差异，在更大龄的肉鸡也很少发生。各种品系肉鸡对本病都易感，其他禽类如火鸡、鹅、雉鸡等也有发病的报道。临床上以突发性死亡率增加，心包积液和肝炎综合征为主要特征。本病的感染途径主要是呼吸道、消化道及眼结膜等，可经机械方式和被带毒粪便污染的器具而在鸡群间、鸡场间迅速传播。国内曾经在非SPF鸡胚传代的疫苗生产用毒种中检测到禽腺病毒的污染，如果污染的疫苗曾经推广使用，可能会引起此病的广泛传播。越来越多的研究表明，心包积液和肝炎综合征的发生与某些免疫抑制病有关，常与引起禽类呼吸道疾病的病原微生物混合感染，随着家禽养殖规模的逐渐扩大，该病的危害也更加严重，对该病的防控现已成为国际禽病研究的热点。

由于目前市场上没有商品化疫苗，腺病毒潜伏期较短仅为24～48小时，而疫苗免疫存在免疫空白期，在鸡群发病后再使用自家苗进行免疫保护效果较差，卵黄抗体不散毒，起效快，使用方便，是控制腺病毒的首选，但是卵黄抗体被动免疫期较短，难以满足免疫保护的需求。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种I群4型腺病毒长效卵黄抗体制备方法，以解决现有技术缺乏针对禽I群4型腺病毒的有效免疫保护手段的技术问题。

本发明要解决的另一技术问题是现有技术中常规卵黄抗体免疫保护时间较短。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种I群4型腺病毒长效卵黄抗体制备方法，包括以下步骤：

1)用I群4型腺病毒灭活疫苗免疫产蛋母鸡，免疫三次，免疫间隔3周；三免后2周取AGP效价≥1:64的高免蛋提取卵黄抗体；

2)利用序列为SEQ ID No:1、SEQ ID No:2的引物，以及腺病毒基因组DNA为模板执行PCR扩增，将扩增产物链接至pMD-18T载体，得到重组载体pMD-18T-FAV，用限制性内切酶EcoR I和Xho I分别对重组载体pMD-18T-FAV和表达载体pET-30a进行双酶切，酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，分别回收目的片段和pET-30a，然后16℃连接过夜；将连接产物转化到E.coliDH5α感受态细胞，挑取单菌落接种到2ml含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基，37℃振荡培养12h，提取质粒后用双酶切进行鉴定，获得表达质粒pET-30a-FAV；

3)将pET-30a-FAV质粒转化到E.coli BL21(DE3)，用原核表达系统表达包涵体蛋白，用Ni螯合树脂柱对蛋白及进行纯化后对包涵体蛋白及进行复性，获得I群4型腺病毒hexon抗原；

4)取步骤1)所得的卵黄抗体，配制抗体琼扩效价为1:16的溶液；取步骤3)所得的I群4型腺病毒hexon抗原，配制抗原琼扩效价为1:16的溶液；将二者等体积混合，得到抗原抗体混合液；

5)取步骤4)所得的抗原抗体混合液，向其中加入2％海藻糖和1％甘露醇冻干保护剂，冻干得到产物。

作为优选，步骤1)中所述提取卵黄抗体，包括以下步骤：取卵黄液经60目尼龙筛过滤后，用胶体磨研磨破碎一遍，加入2.5倍卵黄液体积的50℃～56℃，PH4.8～5.2的醋酸缓冲液稀释，搅拌30分钟，再缓慢加入总体积4％的正辛酸搅拌90分钟，用丙纶750B滤布过滤过夜，即得到澄清的抗体溶液。

作为优选，所述卵黄液是通过以下方法制备的：将高免蛋浸入1％的新洁尔灭溶液中浸泡消毒15min，晾干备用；采取机械打蛋，分离并收集卵黄。