[发明专利]一种I群4型腺病毒长效卵黄抗体制备方法

权利要求书

1.一种I群4型腺病毒长效卵黄抗体制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)用I群4型腺病毒灭活疫苗免疫产蛋母鸡，免疫三次，免疫间隔3周；三免后2周取AGP效价≥1:64的高免蛋提取卵黄抗体；

2)利用序列为SEQ ID No:1、SEQ ID No:2的引物，以及腺病毒基因组DNA为模板执行PCR扩增，将扩增产物链接至pMD-18T载体，得到重组载体pMD-18T-FAV，用限制性内切酶EcoR I和Xho I分别对重组载体pMD-18T-FAV和表达载体pET-30a进行双酶切，酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，分别回收目的片段和pET-30a，然后16℃连接过夜；将连接产物转化到E.coliDH5α感受态细胞，挑取单菌落接种到2ml含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基，37℃振荡培养12h，提取质粒后用双酶切进行鉴定，获得表达质粒pET-30a-FAV；

3)将pET-30a-FAV质粒转化到E.coli BL21(DE3)，用原核表达系统表达包涵体蛋白，用Ni螯合树脂柱对蛋白及进行纯化后对包涵体蛋白及进行复性，获得I群4型腺病毒hexon抗原；

4)取步骤1)所得的卵黄抗体，配制抗体琼扩效价为1:16的溶液；取步骤3)所得的I群4型腺病毒hexon抗原，配制抗原琼扩效价为1:16的溶液；将二者等体积混合，得到抗原抗体混合液；

5)取步骤4)所得的抗原抗体混合液，向其中加入2％海藻糖和1％甘露醇冻干保护剂，冻干得到产物。

2.根据权利要求1所述的一种I群4型腺病毒长效卵黄抗体制备方法，其特征在于步骤1)中所述提取卵黄抗体，包括以下步骤：取卵黄液经60目尼龙筛过滤后，用胶体磨研磨破碎一遍，加入2.5倍卵黄液体积的50℃～56℃，PH4.8～5.2的醋酸缓冲液稀释，搅拌30分钟，再缓慢加入总体积4％的正辛酸搅拌90分钟，用丙纶750B滤布过滤过夜，即得到澄清的抗体溶液。

3.根据权利要求2所述的一种I群4型腺病毒长效卵黄抗体制备方法，其特征在于所述卵黄液是通过以下方法制备的：将高免蛋浸入1％的新洁尔灭溶液中浸泡消毒15min，晾干备用；采取机械打蛋，分离并收集卵黄。

4.根据权利要求1所述的一种I群4型腺病毒长效卵黄抗体制备方法，其特征在于步骤3)所述用原核表达系统表达包涵体，包括以下步骤：挑取单菌落，接种到200mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基，37℃振荡培养12h，后转接到4L相同培养基中，37℃振荡培养3h后，加入IPTG至终浓度为0.5mM，继续培养4h，然后SDS-PAGE电泳分析；挑取工程菌单菌落于200ml含氨苄青霉素浓度0.1g/L的LB液体培养基，37℃恒温振荡过夜培养；将过夜培养物按体积比为1:20的比例倒入总计4L含氨苄青霉素浓度0.1g/L的LB液体培养基，37℃恒温振荡培养3h；然后加入IPTG使其终浓度为5mM，37℃恒温振荡培养4h；将培养物用大型低温冷冻离心机离心，8000rpm，20min；取沉淀，加入结合缓冲液100ml悬浮菌体，然后进行750W超声波破碎；然后4℃，8000rpm，30min，保留沉淀即为沉淀；将5g包涵体中加入120ml的2％(W/V)TritonX-100，用搅拌器搅拌30min，超声破碎40次，搅拌器继续搅拌30min，然后低温冷冻离心8000rpm，30min；再分别用2％，2.2％，2.4％，2.5％(W/V)的TritonX-100各120ml按上述方法洗涤，共洗涤4次，向最后洗涤的包含体沉淀中加入100ml由结合缓冲液配制的、浓度为8mol/L的尿素溶液，用磁力搅拌器搅拌40min，冷冻离心8000rpm，30min，保留上清。

5.根据权利要求4所述的一种I群4型腺病毒长效卵黄抗体制备方法，其特征在于所述超声波破碎的工作时间10s，间隔时间20s，破碎120次。

6.根据权利要求4所述的一种I群4型腺病毒长效卵黄抗体制备方法，其特征在于取由结合缓冲液配制的、浓度为8mol/L的尿素溶液，平衡Ni敖合树脂柱，取所述上清液过该树脂柱；取由结合缓冲液配制的、浓度为8mol/L的尿素溶液，先利用10倍柱床体积的该溶液冲洗层析柱；取由洗涤缓冲溶液配制的、浓度为8mol/L的尿素溶液，利用2倍柱床体积的该溶液洗涤层析柱；取由洗脱缓冲溶液配制的、浓度为8mol/L的尿素溶液，利用30mL该溶液洗脱目的蛋白，收集流出液。