[发明专利]一种利用黑麦草表达的基因重组人血清白蛋白及表达方法

说明书

一种利用黑麦草表达的基因重组人血清白蛋白及表达方法，涉及将重组的人血清白蛋白基因转化到黑麦草当中，并加以表达的方法。目的是解决目前人血清白蛋白来源有限且价格昂贵的问题。方法：一、诱导黑麦草成熟胚形成愈伤组织；二、农杆菌的活化及愈伤组织的转染；三、转染后的愈伤组织的共培养及筛选培养；四、诱导愈伤组织分化；五，诱导植株再生，对转基因黑麦草的性状进行观测，且对DNA与蛋白质水平鉴定为阳性的即为转基因黑麦草。本发明用于获得利用黑麦草转基因表达的基因重组人血清白蛋白。

技术邻域

本发明涉及一种利用黑麦草(Lolium perenne L.)转基因表达的基因重组人血清白蛋白，及其表达方法。

技术背景

人血白蛋白(human serum albumin，HSA)是由585个氨基酸组成的单链无糖基化的蛋白质，分子质量为66.5kD，等电点在4.7-4.9之间。它是人血液中的主要蛋白质，占血浆总蛋白的60％左右，每升人血中含有人血白蛋白约40g。除了血浆之外，人血白蛋白还存在于组织、身体的分泌液、皮肤和淋巴腔中。HSA前体(preproHSA)在肝脏中合成，并且在高尔基体中被加工剪切，形成成熟的HSA分子，释放到血液中，对保持血液的正常渗透压具有重要作用；它在血液中作为多种疏水性分子的载体，其中包括脂肪酸、胆色素、激素、生物学活性物质及药物等，从而调节人体内的多种生理功能。在体外，它作为多种药物的稳定剂被广泛用于多种疾病的治疗、药物载体、动物细胞培养、血浆替代物等。因此，人血白蛋白是一种重要的医用蛋白质，在临床上用于烧伤和严重失血等引起的休克、急性缺血性脑卒中、肾病综合症、肝硬化、肺性脑病、糖尿病性肾病和皮肤溃烂，也可作为血浆增溶剂。血浆白蛋白每下降2.5g/L，死亡危险性增加24％～56％，血浆白蛋白水平<20g/L，患者死亡率几乎是100％。在国际市场上具有巨大的需求，每年的需求量高达500吨以上。

目前，临床使用的人血白蛋白主要是从人源血浆中提取和分离制得。然而，血浆来源受到限制，即有限的血液来源难以满足生产HSA和其相关制剂的需求。另一方面血液自身也可能含有危险的传染病原体如肝炎病毒、HIV病毒等，使得人们对于使用血浆中提取的人血白蛋白存在巨大的担忧。随着基因工程和分子生物学的发展，人们已经试图利用各种不同的表达系统来大批量生产重组人血白蛋白，例如利用原核生物如大肠杆菌(MartinLatta,Michael Knapp,et al.Nature Biotechnology,1309-1314(1987))、枯草芽抱杆菌(Charles W,Saunders CW,et al.Journal of Bacteriology,169:2917-2925(1987))，真核生物如酵母(Kaoru Kobayashi.Biologicals.34:55-59(2006))、转基因动物培养(ShaniM,Barash I,et al.Transgenic Res,1:195-208(1992))等生产人血白蛋白，但这些方法因表达水平较低或生产成本较高，不能用于工业化生产。此外，已有研究表明在转基因水稻(He Y,Ning T,et al.Proc Natl Acad Sci.U.S.A.108 19078–19083(2011))表达的重组人血白蛋白在理化性质及其功能与人源血清白蛋白相似，但水稻的生长周期相对较长，所以在产业化生产中有一定的局限。

发明内容

本发明是针对现有原核与真核生物为生物反应器的表达量低、无生物活性和不安全等特点，为解决目前人血白蛋白来源有限及价格昂贵的问题，利用黑麦草转基因表达一种基因重组人血清白蛋白，包括其表达方法。

本发明利用转基因黑麦草新株系表达基因重组人血清白蛋白的制备过程，按以下步骤进行：

一、将黑麦草成熟种子置于50％H2SO4浸泡处理20-30分钟去皮，纯水漂洗3-5次，至无多余杂质悬浮，吹干去皮后的种子备用；