[发明专利]一种利用黑麦草表达的基因重组人血清白蛋白及表达方法

权利要求书

1.一种利用黑麦草转基因表达的基因重组人血清白蛋白，及其表达方法，其特征在于将人类血清白蛋白基因转入黑麦草并加以表达。

2.按以下步骤将人类血清白蛋白基因转入黑麦草并表达：

一、将黑麦草成熟种子置于50％H2SO4浸泡处理20-30分钟去皮，纯水漂洗3-5次，至无多余杂质悬浮，吹干去皮后的种子备用；

二、选择饱满的去皮种子进行消毒处理，先将籽粒饱满的种子于75％的乙醇中消毒1-2min，然后用无菌水漂洗一次，再用30％(v/v)次氯酸钠溶液消毒5-10min，无菌水冲洗5-6次，用无菌滤纸吸干种子表面水分，纵切为两半接种于愈伤组织诱导培养基中，25℃暗培养，两周后将愈伤组织分离，转入继代培养基，每两周继代一次，培养至愈伤组织转变为胚性愈伤组织；

三、将基因重组人血清白蛋白转基因工程菌划线培养于含利福平50mg/L、卡那霉素50mg/L的YEP固体培养基上，在28℃培养2d，挑取单克隆加入到5ml含卡那霉素50mg/L、利福平50mg/L的YEP培养基中，在28℃、180rpm摇床培养24h后，按体积百分比1:50-1:100的接种量接种到100mL含AS 100uM/L的YEP培养基中，28℃、180rpm摇床培养至OD600达0.6-0.8，获得活化菌液；

四、取活化后的菌液4000g离心10min，将菌体用愈伤组织诱导培养基中重悬稀释至OD600为0.5-0.6，将步骤二中预培养后的胚性愈伤组织至于重悬菌液中，在恒温摇床上于28℃，180rpm浸泡10-20min，然后取出外愈伤组织吸干表面菌液，转入不定芽诱导分化培养基中，于24-26℃黑暗条件下共培养3d；

五、将共培养3d后的愈伤组织用含100mg/L羧苄青霉素的无菌水清洗3次，用无菌滤纸吸干表面水分后，转入不定芽诱导分化培养基中恢复培养1周，然后转入筛选分化培养基中光照节律培养，2周继代一次，至愈伤组织分化出抗性胚芽；

六、将抗性胚芽转接至生根培养基中诱导生根，待形成完整再生植株后炼苗、移栽，对再生黑麦草植株进行性状特征观测；

七、对再生植株进行PCR鉴定以及蛋白质水平的检测，所得阳性植株即为转基因黑麦草。

3.根据权利要求2所述的一种利用黑麦草表达的基因重组人血清白蛋白，其特征在于步骤二中的愈伤组织诱导培养基为MS基本培养基附加5mg/L 2,4-D,0.1mg/L 6-BA和0.5g/L水解酪蛋白。愈伤组织继代培养基为MS基本培养基附加3mg/L 2,4-D,0.1mg/L 6-BA和0.5g/L水解酪蛋白。

4.根据权利要求2所述的一种利用黑麦草表达的基因重组人血清白蛋白，其特征在于步骤四和步骤五中的不定芽诱导分化培养基为MS基本培养基附加2mg/L 6-BA，0.1mg/LNAA和0.5g/L水解酪蛋白。

5.根据权利要求2所述的一种利用黑麦草表达的基因重组人血清白蛋白，其特征在于步骤五中的筛选分化培养基为MS基本培养基附加3mg/L 2,4-D,0.1mg/L 6-BA，50mg/L卡那霉素,250mg/L羧苄青霉素和0.5g/L水解酪蛋白。

6.根据权利要求2所述的一种利用黑麦草表达的基因重组人血清白蛋白，其特征在于步骤五中筛选分化培养条件为：温度24-26℃，光周期为14小时光/10小时暗，光照强度3000Lx。

7.根据权利要求2所述的一种利用黑麦草表达的基因重组人血清白蛋白，其特征在于步骤六中的生根培养基为1/2MS基本培养基附加0.1mg/L IBA。

8.根据权利要求2所述的一种利用黑麦草表达的基因重组人血清白蛋白，其特征在于步骤六中生根培养的条件为：温度24-26℃，光周期为16小时光/8小时暗，光照强度3000Lx。