[发明专利]一种检测细胞分裂素6-BA的化学发光免疫传感器的制备方法及其分析方法

权利要求书

1.一种检测细胞分裂素6-BA的化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)金纳米粒子的制备

将100mL浓度为0.01％的HAuCl4溶液煮沸，然后在搅拌的过程中，向其中加入2.5mL浓度为1％的柠檬酸三钠，继续加热10min后停止加热，待其冷却到室温后将制得的金纳米粒子分散于浓度为1％的壳聚糖醋酸缓冲液中，置于4℃下保存待用；

(2)完全抗原制备

取2ml纯甲醇，依次向该甲醇内加入以下试剂：

2mg细胞分裂素6-BA核苷；

滴加1mL 0.01mol/L NaIO4，室温搅拌20min；

180μL 0.1mol/L乙二醇，室温搅拌10min；

滴加2mL蛋白溶液，所述蛋白溶液中含有10mg牛血清蛋白或10mg卵清蛋白；

滴加浓度为5％的K2CO3调反应液pH至9.3，室温搅拌反应液1h；

2mg NaBH4，每30min加1mg，于4℃下搅拌；

滴加浓度为0.1mol/L HCl调反应液pH至6.5，搅拌反应液1h；

将上述最终得到的反应液于4℃下用2.5L PBS透析，每5h更换透析液一次，透析3天后，将透析所得共轭物质存于0.01mmol/L PBS(pH 7.4)中，于-20℃下保存，所述共轭物质即为包被抗原；

(3)化学发光免疫传感器的组装

用环氧硅烷化的载玻片作为固相载体，将步骤(1)中以壳聚糖分散的金纳米粒子溶液滴涂于载玻片表面并置于4℃下晾干后，将待测抗原对应上述步骤(2)中所制得的包被抗原滴涂于该晾干后的载玻片表面，再将该载玻片置于4℃下反应过夜，然后将其冲洗干净后，用牛血清蛋白将该载玻片上的剩余活性位点封闭，即为免疫传感器。

2.根据权利要求1所述的检测细胞分裂素6-BA的化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于：用于制备金纳米粒子的所有玻璃器皿在使用前用王水浸泡，清洗干净并干燥后使用。

3.根据权利要求1所述的检测细胞分裂素6-BA的化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，固相载体的环氧硅烷化方法为：将载玻片置于水虎鱼酸(H2SO4：H2O2＝7：3，v：v)中浸泡后用去离子水冲洗；将冲洗干净的载玻片置于氮气气氛中吹干后置于含1％GPTMS的甲苯溶液中浸泡，然后依次用甲苯和无水乙醇洗脱载玻片上吸附的GPTMS，最后再将该载玻片置于氮气气氛中吹干。

4.根据权利要求1所述的检测细胞分裂素6-BA的化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，壳聚糖醋酸缓冲液分散的金纳米粒子的浓度为10μmol/L；所述步骤(2)中，包被抗原的浓度为50μg/mL。

5.利用权利要求1的方法制得的检测细胞分裂素6-BA的化学发光免疫传感器的分析方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)将上述制备的免疫传感器组装到免疫微反应器中；

(2)利用流动注射方式，将含待测抗原的样品和相应单克隆抗体注入上述免疫微反应器，温育30min后清洗；

(3)再向上述步骤(2)中清洗结束的免疫微反应器中加入辣根过氧化酶标记的羊抗鼠抗体，温育40min后清洗；

(4)再向上述步骤(3)中清洗结束的免疫微反应器中加入发光底物，用光电倍增管对光信号进行收集和记录。

6.根据权利要求5所述的检测细胞分裂素6-BA的化学发光免疫传感器的分析方法，其特征在于：步骤(1)中所述免疫微反应器为流通池，由带有进口和出口的聚四氟乙烯盖、硅橡胶片和透明塑胶玻璃片组成；所述聚四氟乙烯盖的长×宽×高分别为4.3cm×2.5cm×0.8cm，所述硅橡胶片的厚度为2.0mm，所述透明塑胶玻璃片厚度为5mm。