[发明专利]一种重组谷氨酸棒状杆菌、其制备方法及其应用

说明书

本发明提供了一种重组谷氨酸棒状杆菌，其能有效解决现有谷氨酸棒状杆菌外源蛋白表达量低的技术问题。该重组谷氨酸棒状杆菌中的肽聚糖内切酶基因mepA、细胞膜表面阴离子通道蛋白基因porB和胞内蛋白酶基因clpC均被敲除，同时ABC转运体基因Ncgl0909过量表达。此外，本法还提供了该重组谷氨酸棒状杆菌的制备方法及其应用。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种重组谷氨酸棒状杆菌、其制备方法及其应用。

背景技术

谷氨酸棒状杆菌属于棒状杆菌属，为革兰氏阳性菌。普遍认为谷氨酸棒状杆菌无毒素、无致病性、不产芽孢，被公认是安全菌株（GRAS）。同时谷氨酸棒状杆菌具有生长快速，遗传背景清晰，具有良好的蛋白分泌系统等优点，过去50年里被广泛应用于氨基酸的生产，比如谷氨酸、赖氨酸等，还被应用于食品工业，动物饲料的生产。近些年来也被用于药用蛋白及前体的表达，是一种安全的医药蛋白表达宿主，具有很高的应用价值。

但在实际应用中发现，外源蛋白表达量不尽如人意，因此，有必要对谷氨酸棒状杆菌的宿主菌进行改造使其更有利于外源蛋白的表达。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种重组谷氨酸棒状杆菌，其能有效解决现有谷氨酸棒状杆菌外源蛋白表达量低的技术问题，此外，本法还提供了该重组谷氨酸棒状杆菌的制备方法及其应用。

其技术方案是这样的，一种重组谷氨酸棒状杆菌，所述重组谷氨酸棒状杆菌中的肽聚糖内切酶基因mepA、细胞膜表面阴离子通道蛋白基因porB和胞内蛋白酶基因clpC均被敲除，同时ABC转运体基因Ncgl0909过量表达。

进一步的，重组前的谷氨酸棒状杆菌为C. glutamicum ATCC 13032。

上述重组谷氨酸棒状杆菌的制备方法，其特征在于：所述肽聚糖内切酶基因mepA、所述细胞膜表面阴离子通道蛋白基因porB和所述胞内蛋白酶基因clpC的敲除采用crispr/cas9基因敲除技术，ABC转运体基因Ncgl0909的过量表达采用启动子替换技术。

进一步的，所述crispr/cas9基因敲除技术包括以下步骤：

（1）设计sgRNA，所述肽聚糖内切酶基因mepA、所述细胞膜表面阴离子通道蛋白基因porB和所述胞内蛋白酶基因clpC对应的sgRNA的核苷酸分别如SEQ ID No.1、No.2和No.3所示；

（2）构建同源修复序列，所述肽聚糖内切酶基因mepA、所述细胞膜表面阴离子通道蛋白基因porB和所述胞内蛋白酶基因clpC的同源修复序列分别如SEQ ID No.4、No.5和No.6所示；

（3）整合sgRNA和同源修复序列到载体pcas9allinone中，所述载体pcas9allinone的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，分别形成所述肽聚糖内切酶基因mepA、所述细胞膜表面阴离子通道蛋白基因porB和所述胞内蛋白酶基因clpC敲除的载体pcas9allinone-mepA、pcas9allinone-porB和pcas9allinone-clpC；

（4）构建基因敲除载体，将上述载体pcas9allinone-mepA、pcas9allinone-porB和pcas9allinone-clpC逐个转入到所述谷氨酸棒状杆菌中，经过筛选得到重组菌株3。

进一步的，所述启动子替换技术包括以下步骤：

（1）设计sgRNA，所述启动子为tac启动子，tac启动子的sgRNA的核苷酸序列如 IDNo.7所示；

（2）构建同源修复序列，整合有tac启动子的同源修复序列如SEQ ID No.8所示；