[发明专利]一种重组谷氨酸棒状杆菌、其制备方法及其应用

权利要求书

1.一种重组谷氨酸棒状杆菌在外源蛋白表达中的应用，其特征在于：所述外源蛋白为脑钠肽；

重组后的谷氨酸棒状杆菌中的肽聚糖内切酶基因mepA、细胞膜表面阴离子通道蛋白基因porB和胞内蛋白酶基因clpC均被敲除，同时ABC转运体基因Ncgl0909过量表达；

重组前的谷氨酸棒状杆菌为C. glutamicum ATCC 13032；

所述重组谷氨酸棒状杆菌的制备方法包括，所述肽聚糖内切酶基因mepA、所述细胞膜表面阴离子通道蛋白基因porB和所述胞内蛋白酶基因clpC的敲除采用crispr/cas9基因敲除技术，ABC转运体基因Ncgl0909的过量表达采用启动子替换技术；

所述crispr/cas9基因敲除技术包括以下步骤：

S1、设计sgRNA，所述肽聚糖内切酶基因mepA、所述细胞膜表面阴离子通道蛋白基因porB和所述胞内蛋白酶基因clpC对应的sgRNA的核苷酸序列分别如SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2和SEQ ID No.3所示；

S2、构建同源修复序列，所述肽聚糖内切酶基因mepA、所述细胞膜表面阴离子通道蛋白基因porB和所述胞内蛋白酶基因clpC的同源修复序列分别如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示；

S3、整合步骤S1获得的sgRNA和步骤S2获得的同源修复序列到载体pcas9allinone中，所述载体pcas9allinone的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，分别形成所述肽聚糖内切酶基因mepA、所述细胞膜表面阴离子通道蛋白基因porB和所述胞内蛋白酶基因clpC的敲除载体pcas9allinone-mepA、pcas9allinone-porB和pcas9allinone-clpC；

S4、构建基因敲除载体，将上述载体pcas9allinone-mepA、pcas9allinone-porB和pcas9allinone-clpC逐个转入到所述重组前的谷氨酸棒状杆菌中，经过筛选得到含有基因敲除载体的重组菌株；

所述启动子替换技术包括以下步骤：

S1’、设计sgRNA， sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，sgRNA位于目的基因启动子区域；

S2’、构建同源修复序列，整合有tac启动子的同源修复序列如SEQ ID No.8所示；

S3’、 整合步骤S1’获得的sgRNA和步骤S2’获得的同源修复序列到载体pcas9allinone中，形成载体pcas9allinone-0909；

S4’、获得重组谷氨酸棒状杆菌，将载体pcas9allinone-0909转入步骤S4获得的含有基因敲除载体的重组菌株中，筛选得到重组谷氨酸棒状杆菌。