[发明专利]一种15

说明书

本发明涉及一种¹⁵N稳定性同位素标记5‑甲基脱氧胞苷的制备方法，包括以下步骤：步骤1、选用菌株；步骤2、制备含有¹⁵N氯化铵的葡萄糖培养基和液体活化培养基；步骤3、将步骤1所选用的菌株在步骤2制备两种培养基中培养；步骤4、细菌基因组DNA与细菌基因组DNA提取和保存；步骤5、CviPI DNA甲基化酶催化反应；步骤6、基因组DNA水解，¹⁵N 5‑甲基脱氧胞苷分离纯化。本发明利用微生物合成¹⁵N稳定性同位素标记5‑甲基脱氧胞苷，¹⁵N容易标记且丰度高，工艺简单，制备方便。

技术领域

本发明涉及一种微生物发酵和生物提取方法的领域，尤其涉及一种采用微生物发酵制备稳定性同位素标记化合物的方法。

背景技术

5-甲基胞嘧啶（5-methyl-cytosine）是指在胞嘧啶碱基基团5号碳原子上加合一个甲基基团。5-甲基胞嘧啶具有重要的生物学功能，其在基因组DNA中的含量直接影响着基因的表达与沉默，与生物体的生殖发育、重大疾病的发生和恶化、遗传育种等具有密切的联系。因此，生物体基因组DNA中5-甲基胞嘧啶的含量受到环境毒理学、医学与药物学、遗传育种等科技人员的广泛关注。目前基因组DNA中5-甲基胞嘧啶含量的测定方法较多，其中高效液相色谱串联三重四级杆质谱仪法（LC-MS/MS）检测5-甲基胞嘧啶的胞苷形式5-甲基脱氧胞苷已经被证实为有效且高通量的检测方法。然而由于质谱仪信号的漂移，需要采用稳定性同位素标记的5-甲基脱氧胞苷对质谱仪信号进行校正。

15N稳定性同位素标记5-甲基脱氧胞苷的生产可采用有机合成法，微生物发酵制备法等。采用合成法比较简单，但是需要繁琐的提纯过程，使得15N原料利用率比较低，成本上升。采用直接发酵法生产，目标碱基大量富集，分离比较简单。中国专利公开了一种利用生物发酵法合成15N稳定性同位素标记精氨酸（CN1869244A）、¹⁵N稳定性同位素标记精氨酸（CN101235402A）、¹³C稳定性同位素标记纤维素（CN 10182445A）的方法等。但是，还未见有利用微生物发酵合成并有效制备¹⁵N稳定性同位素标记5-甲基脱氧胞苷的专利报道。

发明内容

本发明设计了一种¹⁵N稳定性同位素标记5-甲基脱氧胞苷的制备方法，其解决的技术问题是现有¹⁵N稳定性同位素标记5-甲基脱氧胞苷的生产方法，存在繁琐的提纯过程，使得¹⁵N原料利用率比较低，成本上升。

为了解决上述存在的技术问题，本发明采用了以下方案：

一种¹⁵N稳定性同位素标记5-甲基脱氧胞苷的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、选用菌株；

步骤2、制备含有¹⁵N氯化铵的葡萄糖培养基和液体活化培养基；

步骤3、将步骤1所选用的菌株在步骤2制备两种培养基中培养；

步骤4、细菌基因组DNA与细菌基因组DNA提取和保存；

步骤5、CviPI DNA甲基化酶催化反应；

步骤6、基因组DNA水解，¹⁵N 5-甲基脱氧胞苷分离纯化。

进一步，步骤1中的菌种选取基因组DNA中胞嘧啶含量丰富的大肠杆菌，以K12位代表。

使用的微生物为大肠杆菌及其突变株，使用菌株为常规菌种，各菌种保藏中心均有保藏。

进一步，所述步骤2中液体活化培养基的其配方为：0.125%（m/v）蛋白胨，0.25%（m/v）酵母提取物，15-35 mM磷酸氢二钠，3-5 mM葡萄糖溶于水，HAC调整pH6.0。