[发明专利]一种15

权利要求书

1.一种¹⁵N稳定性同位素标记5-甲基脱氧胞苷的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、选用菌株；步骤1中的菌种选取基因组DNA中胞嘧啶含量丰富的大肠杆菌；

步骤2、制备含有¹⁵N氯化铵的葡萄糖培养基和液体活化培养基；所述步骤2中液体活化培养基的配方为：0.125%（m/v）蛋白胨，0.25%（m/v）酵母提取物，15-35 mM磷酸氢二钠，3-5mM葡萄糖溶于水，HAC调整pH6.0；所述步骤2中含有¹⁵N氯化铵的葡萄糖培养基：以葡萄糖为唯一碳源的M9基本培养基，其配方为：氯化钠30-80 mM，硫酸二氢钾15-35 mM，氯化钙50-90mM，硫酸镁1-4 mM，葡萄糖5-15 mM，¹⁵N氯化铵30-80 mM的混合水溶液，pH 6-8；

步骤3、将步骤1所选用的菌株在步骤2制备的两种培养基中培养；取1环活化好的步骤1大肠杆菌斜面种子接入步骤2所制得的液体活化培养基，37℃振荡培养12-15小时，摇床转速为160 rpm，作为预培养种子；将所述预培养种子接种到步骤2制得的含有¹⁵N氯化铵的葡萄糖培养基，接种量为5-8%，37 ℃振荡培养48小时，摇床转速为160 rpm；

步骤4、细菌基因组DNA的提取和保存；采用300 g离心力对步骤3所得培养物离心10分钟，收获培养的细菌；采用常规细菌基因组DNA提取试剂盒方法提取基因组DNA，所述试剂盒方法至少包含细菌裂解步骤、RNA酶降解RNA步骤以及柱层析富集DNA步骤；所述基因组DNA保存于含Tris–HCl 10 mM，氯化钠50 mM，二硫苏糖醇1 mM，氯化镁10 mM的pH 7.9混合水溶液体系中；

步骤5、CviPI DNA甲基化酶催化反应；每100 mg 基因组DNA中加入100-200 U CviPIDNA甲基化酶；反应缓冲液含有：s-腺苷甲硫氨酸32-64 mM，氯化钠50 mM，Tris-HCl 50 mM，二硫苏糖醇10 mM，pH 8.5，37 ℃下反应4-6小时；反应结束后加入冰乙醇，12000 g离心提取甲基化后的基因组DNA；

步骤6、基因组DNA水解，¹⁵N 5-甲基脱氧胞苷分离纯化；每100 mg 甲基化后的基因组DNA中加入200-400 U核酸酶P1，1-4 U磷酸二酯酶，300-700 U碱性硫酸酶；反应缓冲液含有：0.1 M乙酸铵，1 M碳酸氢铵，pH 5.3，37 ℃下反应2-6小时；水解后形成的脱氧胞苷混合物经过C18制备分离柱分离，收集洗脱液，经过冷冻干燥后得到¹⁵N 5-甲基脱氧胞苷晶体。