[发明专利]一种用维生素C、L-半胱氨酸和亚硫酸氢钠防止烟草外植体褐化的方法

说明书

本发明是一种用维生素C、L‑半胱氨酸和亚硫酸氢钠防烟草外植体褐化的方法，包括如下步骤：植物种子的消毒、植物种子培养、烟草外植体诱导培养、外植体增殖培养后进行外植体愈伤组织防褐化培养，所述的防褐化培养基为：MS基本培养基中加入防褐添加剂20‑100mg/L维生素C，50‑300mg/L L‑半胱氨酸，50‑100mg/L亚硫酸氢钠，30g/L蔗糖，4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.7。褐化培养处理后，可以有效缓解褐化现象，改善外植体整体的分化状态。添加维生素C、L‑半胱氨酸和亚硫酸氢钠在培养基中，具有使用方便、成本低、效果好等优点。

技术领域

本发明属于植物组织培养领域，具体涉及一种用维生素C、L-半胱氨酸和亚硫酸氢钠防烟草外植体褐化的方法。

背景技术

烟草（Nicotiana tabacum）是茄科一年生草本植物，并作为一种历史悠久的药用植物，同时具有医疗价值。《全国中草药汇编》记载，烟草性温味甘，有毒，具有消肿、解毒、杀虫等功效，主要用于疔疮肿毒，头癣，白癣，秃疮，毒蛇咬伤等症，还可治疗项疽、背痈、风痰等病。也可用于灭钉螺、蚊、蝇、老鼠和杀虫等。它还是重要的经济作物，更是国家和地方财税的重要经济来源。

植物组织培养过程中外植体发生褐化是影响组织培养的重要因素，对于引起植物组织褐化的因素主要是受植物的基因型、外植体影响、培养条件及培养基等影响。由于褐化对于外植体材料产生的毒害作用，将进一步影响植物材料的生长和分化，严重时导致死亡。尽管引起褐化现象的因素较多，但选择合适的外植体，筛选合适的培养基和培养条件能有效地防止褐化^[1]。

但是烟草在组织培养过程中的褐化问题是多发的常见的，几乎不可避免，褐化会导致植株的死亡，也就是培养基中的植物不能继续进行培养，所以防止褐化是在烟草组织培养中要极力解决的问题。

本发明利用在培养基中添加防褐剂维生素C、L-半胱氨酸和亚硫酸氢钠缓解烟草外植体褐化，相关方法未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用维生素C、L-半胱氨酸和亚硫酸氢钠防烟草外植体褐化的方法；该方法可以对植物组培过程中出现的褐化问题得到有效缓解，进而对植物组织培养具有重要作用。

本发明采用解决技术问题方案如下：

一种防止烟草外植体褐化的方法，包括如下步骤：

步骤1：植物种子的消毒：取饱满的烟草种子，然后移至超净工作台上，用75％酒精将种子浸泡30s，无菌水冲洗2遍，再用1％AgNO₃消毒10min，无菌水浸泡清洗5次，用无菌滤纸吸干外植体表面水分后进行接种，其中无菌水为经高压灭菌的超纯水；

步骤2：植物种子培养：将步骤(1)得到的消毒后的种子接种到MS培养基中，在培养温度为25±1℃，光照强度30-50μmol/(m²·s)，光照时间为16h/d的条件下培养60d，种子发芽长成有幼苗，所述MS培养基为MS基本培养基+30g/L蔗糖+4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.7 ；

步骤（3），烟草外植体诱导培养：将步骤(2)中得到的幼苗置于MS诱导培养基中，控制白天温度为28℃，夜间温度为25℃，光照强度为30-50μmol/(m²·s)，光照时间为16小时/天，培养时间为18天，诱导得到烟草外植体愈伤组织，诱导率为46.2-95.8％，所述MS诱导培养基为：MS基本培养基+1-2mg/L6-苄基腺嘌呤6-BA+0.2-0.5mg/L噻重氮苯基脲TDZ+0.1-1.0mg/L萘乙酸NAA+0.1-1.0mg/L2,4-二氯苯氧乙酸2,4-D+30g/L蔗糖+4.5g/L琼脂，培养基的pH值为5.7；