[发明专利]一种用维生素C、L-半胱氨酸和亚硫酸氢钠防止烟草外植体褐化的方法

权利要求书

1.一种用维生素C、L-半胱氨酸和亚硫酸氢钠防烟草外植体褐化的方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤1：植物种子的消毒;

步骤2：植物种子培养：将步骤(1)得到的消毒后的种子接种到MS培养基中，在培养温度为25±1℃，光照强度30-50μmol/(m²·s)，光照时间为16h/d的条件下培养60d，种子发芽长成有幼苗，所述MS培养基为MS基本培养基+30g/L蔗糖+4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.7 ；

步骤（3），烟草外植体诱导培养：将步骤(2)中得到的幼苗置于MS诱导培养基中，控制白天温度为28℃，夜间温度为25℃，光照强度为30-50μmol/(m²·s)，光照时间为16小时/天，培养时间为18天，诱导得到烟草外植体愈伤组织，诱导率为46.2-95.8％，所述MS诱导培养基为：MS基本培养基+1-2mg/L6-苄基腺嘌呤6-BA+0.2-0.5mg/L噻重氮苯基脲TDZ+0.1-1.0mg/L萘乙酸NAA+0.1-1.0mg/L2,4-二氯苯氧乙酸2,4-D+30g/L蔗糖+4.5g/L琼脂，培养基的pH值为5.7；

步骤（4），烟草外植体增殖培养：将步骤(3)中得到的烟草外植体愈伤组织置于MS增殖培养基中，控制白天温度为28℃，夜间温度为25℃，光照强度为30-50μmol/(m²·s)，光照时间为16小时/天，培养时间为7天，烟草外植体愈伤组织逐渐分化增殖，增殖率为49.7-64.3％；所述的MS增殖培养基为：MS基本培养基中加入0.1-1.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.5-2.0mg/L萘乙酸NAA、0.1-0.5mg/L激动素KT、30g/L蔗糖、4.5 g/L琼脂，培养基的pH值为5.7；

步骤（5），烟草外植体防褐化培养：将步骤(4)中得到的烟草外植体愈伤组织置于MS防褐化培养基中，控制白天温度为28℃，夜间温度为25℃，光照强度为30-50μmol/(m2·s)，光照时间为16小时/天，培养时间为40天，烟草外植体愈伤组织褐化率为8.2-31.7％；MS防褐化培养基为：MS基本培养基中加入防褐添加剂20-100mg/L维生素C，50-300mg/L L-半胱氨酸、50-100mg/L亚硫酸氢钠、30g/L蔗糖、4g/L琼脂，培养基的pH值为5.7，防褐添加剂维生素C与L-半胱氨酸的加入是在培养基冷却至50℃左右加入。

2.根据权利要求1所述的用维生素C、L-半胱氨酸和亚硫酸氢钠防烟草外植体褐化的方法，其特征在于：步骤1中所述的植物种子的消毒是：取饱满的植物种子移至超净工作台上，用75％酒精将植物种子浸泡30s，无菌水冲洗2遍，再用1％AgNO₃消毒10min，无菌水浸泡清洗5次，用无菌滤纸吸干植物种子表面水分后进行接种，所述的无菌水为经高压灭菌的超纯水。