[发明专利]一种多物质组合的烟草外植体防褐化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种烟草外植体防褐化方法，具体是一种多物质组合的烟草外植体防褐化方法，属于植物组织培养领域。

背景技术

褐化是指外植体在诱导脱分化或再分化过程中，自身组织从表面向培养基释放褐色物质，以至培养基逐渐变成褐色，外植体也随之进一步变褐而死亡的现象。褐化的发生是由于组织中多酚氧化酶被激活，酚类化合物被氧化形成褐色的醌类物质。醌类化合物在酪氨酸酶的作用下，与培养材料组织中的蛋白质发生聚合，与培养材料组织中的蛋白质发生聚合引起其他酶系统失活，导致代谢紊乱，生长受阻。

对于引起植物组织褐化的因素已有研究报道，引起组织培养中外植体褐化的主要因素是受植物的基因型、外植体影响、培养条件及培养基等影响。由于褐化对于外植体材料产生的毒害作用，将进一步影响植物材料的生长和分化，严重时导致死亡。尽管引起褐化现象的因素较多，但选择合适的外植体，筛选合适的培养基和培养条件能有效地防止褐化。

烟草（Nicotiana tabacum）是茄科烟草属植物，现主要分布在南美洲、南亚和中国等地区。它不仅是重要的经济作物，更是国家和地方财税的重要经济来源。烟草有多种用途，可用于医药等领域，有研究者在花烟草中发现一种能够杀死癌细胞的新蛋白质化合物。但是烟草在组织培养过程中的褐化问题是多发的常见的，几乎不可避免，褐化会导致植株的死亡，也就是培养基中的植物不能继续进行培养，所以防止褐化是在烟草组织培养中要极力解决的问题。

目前有使用防褐剂的相关研究，然而，防褐剂并非越多效果越好，不同种类和数量的防褐剂组合不恰当反而会影响植物本身生长，而且其他用途的物质加入可能会有难以预料的效果，值得探索。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供基于多物质组合的烟草外植体防褐化方法。

本发明采用解决技术问题方案如下：

一种多物质组合的烟草外植体防褐化方法，包括如下步骤：

步骤（1），种子的消毒；

步骤（2），种子培养：将步骤（1）得到的种子接种到MS培养基中培养，种子发芽长成幼苗；种子的培养条件为：在培养温度为25±1℃，光照强度30-50μmol/(m²·s)，光照时间为16h/d的条件下培养60d；

步骤（3），烟草外植体培养：将步骤（2）中得到的幼苗，利用打孔器进行打孔得到烟草叶盘，将叶盘置于MS分化培养基中培养，培养条件为：28℃光照培养16h/d，光照强度30-50μmol/(m²·s)，25℃黑暗培养8h/d，培养5d，得到外植体；所述叶盘MS分化培养基为MS基本培养基中添加0.5mg/L的萘乙酸NAA、2mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、30g/L蔗糖，4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.7；

步骤（4），防褐化培养：将步骤（3）中得到的外植体置于MS防褐化培养基中，在28℃光照培养16h/d，光照强度30-50μmol/(m²·s)，25℃黑暗培养8h/d的条件下培养40d，MS防褐化培养基为MS基本培养基中添加5-12.5g/L氯化钙，2.5-7.5g/L D-异抗坏血酸钠，1-4g/L柠檬酸、30g/L蔗糖和4g/L的琼脂，培养基的pH值为5-6。

进一步地，步骤（1）中，种子消毒的具体步骤为：取饱满的烟草种子，然后移至超净工作台上，用75％酒精将种子浸泡30s，无菌水冲洗2遍，再用1％AgNO₃消毒10min，无菌水浸泡清洗5次，用无菌滤纸吸干外植体表面水分后进行接种，其中无菌水为经高压灭菌的超纯水。

进一步地，步骤（2）中，MS培养基为MS基本培养基中添加30g/L蔗糖和4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.7。

进一步地，步骤（4）中，MS防褐化培养基的制备方法如下：

A、D-异抗坏血酸钠的制备：称取D-异抗坏血酸钠溶于无菌水中，在超净工作台中使用滤头过滤灭菌，制成浓度为50g/L的溶液；

B、柠檬酸的制备：称取柠檬酸溶于无菌水中，在超净工作台中使用滤头过滤灭菌，制成浓度为40g/L的溶液；

C、配制1L MS防褐化培养基：将MS基本培养基4.43g，30g蔗糖和1L超纯水混合，并调节培养基的pH值为5.7；

D、防褐化培养基中添加防褐添加剂5-12.5g/L氯化钙，4g琼脂，121℃灭菌15min；

E、灭菌后，添加2.5-7.5g/L D-异抗坏血酸钠，1-4g/L柠檬酸，摇匀，即得到MS防褐化培养基。