[发明专利]一种多物质组合的烟草外植体防褐化方法

权利要求书

1.一种多物质组合的烟草外植体防褐化方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤（1），种子的消毒；

步骤（2），种子培养：将步骤（1）得到的种子接种到MS培养基中培养，种子发芽长成幼苗；种子的培养条件为：在培养温度为25±1℃，光照强度30-50μmol/(m²·s)，光照时间为16h/d的条件下培养60d；

步骤（3），烟草外植体培养：将步骤（2）中得到的幼苗，利用打孔器进行打孔得到烟草叶盘，将叶盘置于MS分化培养基中培养，培养条件为：28℃光照培养16h/d，光照强度30-50μmol/(m²·s)，25℃黑暗培养8h/d，培养5d，得到外植体；所述叶盘MS分化培养基为MS基本培养基中添加0.5mg/L的萘乙酸NAA、2mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、30g/L蔗糖，4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.7；

步骤（4），防褐化培养：将步骤（3）中得到的外植体置于MS防褐化培养基中，在28℃光照培养16h/d，光照强度30-50μmol/(m²·s)，25℃黑暗培养8h/d的条件下培养40d，MS防褐化培养基为MS基本培养基中添加5-12.5g/L氯化钙，2.5-7.5g/L D-异抗坏血酸钠，1-4g/L柠檬酸、30g/L蔗糖和4g/L的琼脂，培养基的pH值为5-6。

2.根据权利要求1所述的多物质组合的烟草外植体防褐化方法，其特征在于：步骤（1）中，种子消毒的具体步骤为：取饱满的烟草种子，然后移至超净工作台上，用75％酒精将种子浸泡30s，无菌水冲洗2遍，再用1％AgNO₃消毒10min，无菌水浸泡清洗5次，用无菌滤纸吸干外植体表面水分后进行接种，其中无菌水为经高压灭菌的超纯水。

3.根据权利要求1所述的多物质组合的烟草外植体防褐化方法，其特征在于：步骤（2）中，MS培养基为MS基本培养基中添加30g/L蔗糖和4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.7。

4.根据权利要求1所述的多物质组合的烟草外植体防褐化方法，其特征在于：步骤（4）中，MS防褐化培养基的制备方法如下：

A、D-异抗坏血酸钠的制备：称取D-异抗坏血酸钠溶于无菌水中，在超净工作台中使用滤头过滤灭菌，制成浓度为50g/L的溶液；

B、柠檬酸的制备：称取柠檬酸溶于无菌水中，在超净工作台中使用滤头过滤灭菌，制成浓度为40g/L的溶液；

C、配制1L MS防褐化培养基：将MS基本培养基4.43g，30g蔗糖和1L超纯水混合，并调节培养基的pH值为5.7；

D、防褐化培养基中添加防褐添加剂5-12.5g/L氯化钙，4g琼脂，121℃灭菌15min；

E、灭菌后，添加2.5-7.5g/L D-异抗坏血酸钠，1-4g/L柠檬酸，摇匀，即得到MS防褐化培养基。