[发明专利]一种基于活性炭的烟草外植体防褐化方法

说明书

本发明涉及一种基于活性炭的烟草外植体防褐化方法，包括如下步骤：步骤（1），种子消毒；步骤（2），种子培养；步骤（3），烟草外植体培养；步骤（4），防褐化培养；步骤（5），生根培养；步骤（6），炼苗移栽。本发明不仅可以有效缓解烟草外植体褐化现象，还可以改善外植体整体的分化状态。根系不仅生长加快，而且质地柔韧不易折断，生根苗移栽成活率高。使用方便、成本低、效果好。

技术领域

本发明涉及一种烟草外植体防褐化方法，具体涉及一种基于活性炭的烟草外植体防褐化方法，属于植物组织培养领域。

背景技术

植物组织培养过程中外植体发生褐化是影响组织培养的重要因素。有研究表明，外植体褐化是由于组织中多酚氧化酶被激活，酚类物质被氧化后产生醌类物质抑制其他酶的活性，毒害整个外植体组织。

目前的研究表明引起组织培养中外植体褐化的原因有：植物的基因型、外植体自身、培养条件、培养基等。尽管引起褐化现象的因素较多，但选择合适的外植体，筛选合适的培养基和培养条件能有效地防止褐化。但是，长时间进行弱光照培养会降低外植体的生活能力，甚至引起死亡。

烟草（Nicotiana tabacum）不仅是重要的经济作物，更是进行基因功能研究的模式植物。烟草在组织培养过程中的褐化问题也是多发的常见的，褐化会导致培养基中的烟草外植体不能继续进行培养，甚至死亡，所以防止褐化是在烟草组织培养中要极力解决的问题。

另外，褐化剂使用不当或者培养基、培养条件选用不当会造成烟草根系脆弱、生长缓慢，进而，如何在解决褐化问题的同时加强烟草根系的韧度，是目前急需解决的问题。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种基于活性炭的烟草外植体防褐化方法，有效缓解烟草组培过程中出现的褐化问题，提高烟草组织培养的外植体存活率，同时提高根系的韧度。

本发明的具体方案如下：

一种基于活性炭的烟草外植体防褐化方法，包括如下步骤：

步骤（1），种子消毒；

步骤（2），种子培养：将步骤（1）得到的种子接种到MS培养基中培养，种子发芽长成幼苗；种子培养条件为：培养温度为25±1℃，光照强度30-50μmol/(m²·s)，光照时间为16h/d的条件下培养60d；

步骤（3），烟草外植体培养：将步骤（2）中得到的幼苗，利用打孔器进行打孔得到烟草叶盘，将叶盘置于MS分化培养基中培养，培养条件为：28℃光照培养16h/d，光照强度30-50μmol/(m²·s)，25℃黑暗培养8h/d，培养5d，得到外植体；

步骤（4），防褐化培养：将步骤（3）中得到的外植体置于MS防褐化培养基中培养，在28℃光照培养16h/d，光照强度30-50μmol/(m²·s)，25℃黑暗培养8h/d的条件下培养40d，MS防褐化培养基为MS基本培养基中添加0.5-5g/L活性炭、30g/L蔗糖和4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.7；

步骤（5），生根培养：将步骤（4）中得到的外植体置于MS生根培养基中培养，在28℃光照培养16h/d，光照强度30-50μmol/(m²·s)，25℃黑暗培养8h/d的条件下培养，培养10d时烟草生根；MS生根培养基为MS基本培养基中加入0.5-5g/L活性炭、30g/L蔗糖和4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.7。

步骤（6），炼苗移栽：待步骤（5）中得到的生根植株培养25d时，其根系发达后，打开封口膜，向培养瓶内倒入适量水至于温室内，水的位置高于培养基1-2cm，放置阴暗处生长1-2d后，带培养基一起置于稍干燥的天然土壤中，套上扎孔透明塑料袋，培养7d，移到室外。