[发明专利]一种基于活性炭的烟草外植体防褐化方法

权利要求书

1.一种基于活性炭的烟草外植体防褐化方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤（1），种子消毒；

步骤（2），种子培养：将步骤（1）得到的种子接种到MS培养基中培养，种子发芽长成幼苗；种子培养条件为：培养温度为25±1℃，光照强度30-50μmol/(m²·s)，光照时间为16h/d的条件下培养60d；

步骤（3），烟草外植体培养：将步骤（2）中得到的幼苗，利用打孔器进行打孔得到烟草叶盘，将叶盘置于MS分化培养基中培养，培养条件为：28℃光照培养16h/d，光照强度30-50μmol/(m²·s)，25℃黑暗培养8h/d，培养5d，得到外植体；

步骤（4），防褐化培养：将步骤（3）中得到的外植体置于MS防褐化培养基中培养，在28℃光照培养16h/d，光照强度30-50μmol/(m²·s)，25℃黑暗培养8h/d的条件下培养40d，MS防褐化培养基为MS基本培养基中添加0.5-5g/L活性炭、30g/L蔗糖和4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.7；

步骤（5），生根培养：将步骤（4）中得到的外植体置于MS生根培养基中培养，在28℃光照培养16h/d，光照强度30-50μmol/(m²·s)，25℃黑暗培养8h/d的条件下培养，培养10d时烟草生根；MS生根培养基为MS基本培养基中加入0.5-5g/L活性炭、30g/L蔗糖和4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.7；

步骤（6），炼苗移栽：待步骤（5）中得到的生根植株培养25d时，其根系发达后，打开封口膜，向培养瓶内倒入适量水至于温室内，水的位置高于培养基1-2cm，放置阴暗处生长1-2d后，带培养基一起置于稍干燥的天然土壤中，套上扎孔透明塑料袋，培养7d，移到室外。

2.根据权利要求1所述的基于活性炭的烟草外植体防褐化方法，其特征在于：步骤（3）中，所述MS分化培养基为MS基本培养基中添加0.5mg/L的萘乙酸NAA、2mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、30g/L蔗糖和4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.7。

3.根据权利要求1所述的基于活性炭的烟草外植体防褐化方法，其特征在于：步骤（1）中，种子消毒的具体步骤为：取饱满的烟草种子，然后移至超净工作台上，用75％酒精将种子浸泡30s，无菌水冲洗2遍，再用1％AgNO₃消毒10min，无菌水浸泡清洗5次，用无菌滤纸吸干外植体表面水分后进行接种，其中无菌水为经高压灭菌的超纯水。

4.根据权利要求1所述的基于活性炭的烟草外植体防褐化方法，其特征在于：步骤（2）中， MS培养基为MS基本培养基中添加30g/L蔗糖和4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.7。

5.根据权利要求1所述的基于活性炭的烟草外植体防褐化方法，其特征在于：步骤（4）中，MS防褐化培养基制备方法如下：

将4-5g MS基本培养基、10-40g蔗糖和1L超纯水混合，并调节培养基的pH值为5.7，然后添加0.5-5g活性炭和3-6g琼脂，在121℃下灭菌15min。