[发明专利]一种乙醇耐受纤维素酶的连续发酵方法

说明书

本发明公开了一种乙醇耐受纤维素酶的连续发酵方法，属于酶工程以及发酵工程领域。本发明方法包括如下步骤：使用黑曲霉孢子液喷洒到柱状活性碳上培养得到活化的柱状活性碳；往发酵罐中加入培养基、活化的柱状活性碳，发酵1.5‑3d；加入活性碳纳米粉末和葡萄糖，发酵1.5‑3d；再次加入活性碳纳米粉末，发酵1‑2d，发酵醪液放出发酵罐，用滤网过滤，滤液为第一批次发酵醪液，滤网上的固定黑曲霉菌丝的柱状活性碳用于下一批次发酵；重复上述发酵步骤多次。本发明利用柱状活性碳作为黑曲霉菌丝的载体，同时用活性碳纳米粉末减轻葡萄糖的反馈抑制作用，达到了持续不断高强度产生乙醇耐受纤维素内切酶的目的。

技术领域

本发明涉及酶工程以及发酵工程领域，具体涉及一种乙醇耐受纤维素酶的连续发酵方法。

背景技术

纤维素酶能降解谷物和薯类中的纤维素转化为可发酵的糖类，同时能促进淀粉酶降解淀粉，从而提高酿酒出酒率。酿酒过程中谷壳或高粱外壳等纤维素的降解能提升酒糟饲料的适口性，促进酒糟饲料的高质开发。纤维素酶对酿酒行业实现“高质、高产、低耗”的生产具有重要的意义。

全球每年光合作用产生的纤维素资源超过100亿吨。利用绿色可再生纤维素资源生产乙醇等生物燃料对减缓温室效应、全球可持续发展具有不可估量的意义。纤维素的高效降解是利用纤维素生产乙醇等生物燃料的关键。纤维素酶降解纤维素具有反应条件温和、污染少、效率高等特点，其降解纤维素生产生物燃料具有广阔的应用前景。但是纤维素酶降解纤维素生产生物燃料的成本较高，是亟待突破的现实瓶颈。

纤维素酶耐受乙醇分子的改造和生产是降低纤维素生产燃料乙醇成本的关键技术之一。纤维素降解生产燃料乙醇的工艺分为两种：先糖化后发酵与边糖化边发酵。先糖化后发酵工艺为：先利用纤维素酶降解纤维素为葡萄糖，然后加入酒精酵母，利用酒精酵母的代谢把葡萄糖转化为乙醇。该工艺中，纤维素降解产物葡萄糖的反馈抑制作用会大幅度降低纤维素的降解效率。边糖化边发酵工艺为：酒精酵母和纤维素酶同时加入到纤维素原料中，纤维素酶降解纤维素产生的葡萄糖被酵母转化为乙醇。该工艺能解除葡萄糖的反馈抑制作用，但是随着乙醇浓度的增加，乙醇非耐受纤维素酶的降解活性大幅度降低。耐受乙醇纤维素酶能在乙醇溶液中维持较高的降解活性。耐受乙醇的纤维素酶与酵母同步加入到纤维素基质中，不仅能有效解除葡萄糖的反馈抑制作用，而且能在含乙醇的体系中保持较高的降解活性，从而降低纤维素酶降解纤维素生产燃料乙醇的成本。耐受乙醇纤维素酶对降低纤维素生产生物燃料具有重要的实际意义。在液态或固态酿酒时，纤维素酶也处于乙醇含量较高的发酵体系中，耐受乙醇的纤维素酶能更高效降解原料中的纤维素，提高出酒率。

纤维素酶是由纤维素外切酶、纤维素内切酶、β-葡糖苷酶三种酶组成。纤维素外切酶首先破坏纤维素的晶体结构，把晶体纤维素转化为可溶的纤维素大片段分子。纤维素内切酶降解可溶的纤维素大片段分子，产生纤维二糖，纤维二糖在β-葡糖苷酶的作用下转变为葡萄糖。纤维素酶降解纤维素是一个协同降解的过程。纤维素复合酶系的耐受性取决于纤维素外切酶、纤维素内切酶、β-葡糖苷酶三种酶的耐受性。纤维素内切酶在纤维素的降解中，处于降解过程的承接地位，纤维素内切酶的乙醇耐受性是纤维素酶耐受乙醇的关键。已有研究中，为了诱导黑曲霉产生纤维素酶，往往限制碳源的供应，这样黑曲霉的菌丝逐渐衰亡，产酶能力下降。

发明内容

本发明的目的在于提供一种乙醇耐受纤维素酶的连续发酵方法，通过该方法能够持续不断高强度产生乙醇耐受的纤维素内切酶。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种乙醇耐受纤维素酶的连续发酵方法，包括如下步骤：

(1)黑曲霉孢子接种柱状活性碳：使用培养基将黑曲霉孢子调为浓度1-1.5×10⁸/mL的孢子液，将孢子液均匀喷洒到灭菌后的柱状活性碳上，在30-35℃培养20-24h，得到初步活化的柱状活性碳。该步骤中，每1.0kg柱状活性碳优选喷洒150-250mL孢子液。