[发明专利]一种适应PK-15全悬浮生长的无血清培养基及其制备方法和应用于PK-15细胞的全悬浮驯化方法

说明书

本发明涉及一种适应PK‑15全悬浮生长的无血清培养基及其制备方法和应用于pK‑15细胞的全悬浮驯化方法，该培养基包含氨基酸、吐温、亚油酸、维生素E、豆蔻酸、硬脂酸、维生素A、β‑巯基乙醇、氯化钠、葡萄糖、氯化镉、亚油酸、氯化胆碱、肌醇和偏钒酸铵等物质。本发明提供的无血清培养基，能够实现PK‑15细胞全悬浮生长，从而省略微载体成本及消化过程，解决PK‑15细胞微载体悬浮培养过程中难以消化放大的技术问题。

技术领域

本发明属于细胞工程领域，涉及一种无蛋白无水解物成分明确的无血清培养基，尤其涉及一种适用于PK-15细胞全悬浮培养的无血清培养基及其制备方法和应用于pK-15细胞的全悬浮驯化方法。

背景技术

细胞培养是蛋白、多肽类药物、疫苗等生物制品生产中最核心、最基础的技术，细胞培养基为细胞体外培养提供生长所需的营养和适宜的环境，是体外细胞培养的基础和关键因素。一般细胞培养基由无机盐、氨基酸、维生素、碳源、微量元素等成分组成。

PK-15细胞是动物疫苗生产中常用的一种细胞，其主要用来生产猪圆环病毒2型(PCV2)和猪细小病毒(PPV)等。PK-15细胞属于贴壁依赖型细胞，目前技术培养方式有两种：转瓶贴壁培养和微载体悬浮培养，两种方法本质上都属于贴壁培养；培养所用培养基多数为常规培养基(MEM)，培养过程需添加8％左右血清，少数厂家使用低血清培养基或者无血清培养基。然而转瓶培养科技含量较低，劳动强度大、占地面积大并且批件差异难以控制，抗原生产过程中外源污染风险较大；而微载体培养虽然极大程度上降低了劳动强度和生产场地，但微载体成本高昂，细胞本质上还是贴壁培养，放大过程需要胰酶消化，由于PK-15细胞属于比较难消化的细胞株，并且反应器中的消化传代放大工艺繁琐、污染风险较大，因此放大过程是PK-15细胞微载体悬浮培养中的一大缺陷；

细胞全悬浮培养是指将贴壁依赖性细胞驯化成非贴壁依耐性细胞，不需要添加微载体及其它贴壁载体，直接将细胞在摇瓶或生物反应其中进行悬浮培养。因此细胞全悬浮培养完全省略了微载体成本及消化过程，可以完全解决微载体悬浮培养过程中的消化放大的技术瓶颈，拥有非常显著优势。然而，PK-15细胞全悬浮培养对细胞培养基要求非常高，需要针定制型的全悬浮培养基，具有专一性。目前，应用于PK-15细胞培养扩增阶段的培养基多为采用5％-10％血清浓度的常规培养基如MEM、DMEM,或者部分采用低血清或无血清培养基，但这些培养基都只是适用于贴壁培养，无法支持PK-15细胞全悬浮培养；这是因为使用普通常规培养基或无血清培养基在培养PK-15细胞过程中会出现细胞严重成团，不生长或生长缓慢等问题。

综上所述，PK-15细胞全悬浮培养的技术难点首先在于需要一个针对性的全悬浮培养基，其次是需要有正确可行的驯化方法。

发明内容

从以上分析可以看出，目前PK-15细胞培养技术使用的是贴壁培养，而使用的培养基也全部是用于贴壁培养，目前还没有适用于PK-15细胞全悬浮培养的细胞培养基，特别是成分明确的无血清培养基。为解决以上问题，本发明了一种针对PK-15全悬浮培养的成分明确的无血清培养基，将目前的生产技术从贴壁培养提高到了科技含量更高、工艺更加先进的全悬浮培养。

本发明提供了一种适应PK-15全悬浮生长的无血清培养基，由如下组分制备而成：

上述适应PK-15全悬浮生长的无血清培养基中配方组分均为商品化的生化试剂。

上述适应PK-15全悬浮生长的无血清培养基的制备方法为：首先将1～10mg吐温80溶解于50毫升注射用水中，然后加入0.15-0.5mg亚油酸、0.2-2mg维生素E、0.2-0.8mg豆蔻酸、0.18-0.5mg硬脂酸、5-50mg维生素A，待其溶解充分，用注射用水补液至500毫升，再向其中加入1-20mgβ-巯基乙醇、2-8g氯化钠、8-15g葡萄糖，搅拌至澄清，用注射用水补液至900毫升，然后加入：