[发明专利]基于液相芯片法的NRAS突变检测试剂盒和延伸引物

说明书

本发明公开了一种NRAS基因检测特异性引物和液相芯片，该液相芯片主要包括有：针对NRAS基因的2号外显子上的12号密码子、13号密码子，3号外显子上的第61位密码子、4号外显子上的146号密码子中的18个突变基因类型及野生基因型分别设计ASPE延伸引物，有anti‑tag序列包被的、具有不同颜色编码的磁珠；用于扩增出需要检测的、具有相应突变位点的目标序列的引物。本发明所述NRAS基因突变检测液相芯片可用于检测NRAS基因的18种突变类型，检测位点更加全面，提供的结果更加可靠，为医生提供更加准确的诊断依据。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种NRAS基因突变检测试剂盒和延伸引物，可利用液相芯片技术检测与癌症相关的NRAS基因突变。

背景技术

Ras基因是一种原癌基因，在细胞的讯息传递路径上，主要为活化控制基因转录的激酶，调节细胞的增殖与分化，是EGFR信号转导通路中一个重要的下游调控基因。在正常细胞中，RAS以非活化状态(GDP结合型)存在，当受到外源信号刺激，RAS发生磷酸化，构象改变而成为活化的GTP结合型，活化的GTP-RAS激活下游RAF信号转导蛋白，直到被降解。RAS基因致瘤性点突变会降低RAS蛋白水解GTP为GDP的能力，导致RAS蛋白与GTP持续性结合，引起下游通路持续性激活，使细胞产生不依赖于生长因子的恶性增殖，导致癌症的发生。

神经细胞瘤鼠肉瘤癌基因(Neuroblastoma ras viral oncogene homolog，NRAS)是Ras基因家族成员之一。NRAS基因的突变主要位于第2、3、4外显子上，导致多种恶性肿瘤，在结直肠癌(colorectal cancer,CRC)患者中的突变率为1-6％，在恶性黑素瘤(malignantmelanoma)中的突变概率是20％，是人体肿瘤中常见的致癌基因。临床研究发现NRAS突变的结直肠癌患者在对以西妥昔单抗为主的EGFR单抗药物敏感性显著降低,故NRAS基因突变是抗表皮生长因子受体单抗治疗疗效的独立预测因素。NRAS基因检测已被欧美地区列为大肠癌患者内科治疗前必做的常规检查、美国癌症综合网络(NCCN)的《NCCN结肠癌临床实践指南》与《NCCN直肠癌临床实践指南》列为临床用药必检项目。此外，也有相关的研究表明NRAS突变与肺癌治疗中的TKI耐药有关。也有临床数据表明以Cdk4为药物靶标的抑制剂与MEK抑制剂联合使用可以治疗NRAS突变的黑色素瘤患者。综上，越来越多的证据显示，NRAS突变在人类黑色素瘤、结直肠癌、肺癌等很多肿瘤的发生发展中具有重要意义。因此，在进行相关癌症治疗中，检测患者是否存在相关的NRAS基因功能性突变，可准确预测分子靶向药物治疗的有效性，便于临床准确用药，显著提高药物疗效，使患者最大程度受益，还可以避免不合理用药造成的病人医疗费用负担及社会医疗资源的浪费。

当前，针对于人NRAS基因突变检测的试剂盒基本基于荧光PCR技术平台开发的，最多的突变类型检测也只有9种。虽然荧光PCR与液相芯片技术均具有高通量、高灵敏度等特点,可缩短检测周期、减少成本和提高效率等优点。PCR此前，本发明的发明人研发过NRAS基因突变检测特异性引物和液相芯片(ZL2011102697755)，其检测的位点包括NRAS基因2号外显子、3号外显子、4号外显子上面13种基因突变类型。而在实际临床应用中，发现上述检测位点还不能满足单管全面检测分析的需要。

发明内容

本发明的目的之一是提供NRAS基因突变检测液相芯片，该液相芯片可用于检测NRAS基因的2号外显子、3号外显子、4号外显子上所以与结直肠癌、非小细胞肺癌、恶性黑色素瘤相关的18种基因突变类型即G34A、G34T、G34C、G35A、G35C、G35T、G37C、G37T、G38A、G38T、G38C、C181A、A182C、A182T、A182G、A183T、G436A、G437T与正常的三种基因型，提供更较全面、精确、便捷的检测方式，克服了当前单管检测单一反应，检测位点单一，灵敏度不高，检测成本高的缺点，为临床治疗提供有力的证据。

实现上述目的技术方案如下。