[发明专利]利用悬浮培养的地黄茎形成层干细胞生产梓醇的方法

说明书

本发明公开了一种利用悬浮培养的地黄茎形成层干细胞生产梓醇的方法，具体包括：以地黄属植物茎为外植体，通过诱导培养、分离培养和继代培养建立稳定生长的地黄形成层干细胞培养体系；然后于生物反应器中加入联合诱导子β‑CD和茉莉酸甲酯进行悬浮培养，之后经超声提取、大孔树脂吸附、高效液相制备柱进行精制后得到高纯度的梓醇。本发明利用的植物干细胞培养体系具有同步生长、遗传性状稳定、生长速度快、梓醇合成稳定等优良特性，其作为制备梓醇的原料，为梓醇的制备提供了一种新方法；此外，与化学合成相比，本发明利用生物反应器培养技术结合植物干细胞培养技术生产高纯度梓醇，具有生产周期短，安全性高，成本低，产量高，低污染等优点。

技术领域

本发明属于医药生物工程技术领域，特别涉及一种利用悬浮培养的地黄属植物茎形成层干细胞生产梓醇的方法。

背景技术

地黄是我国最著名的中药材之一，据统计，约有80多种中成药以生地黄为主要原料，如六味地黄丸、知柏地黄丸、乌鸡白凤丸、消糖丸等。梓醇是地黄中主要活性成分之一，具有广泛的药理活性，如降血糖、抗肿瘤、抗炎、抗病毒、神经保护等。2017年1月25日，青海央宗药业有限公司自主研发的“梓醇片”取得国家食品药品监督管理局中药一类药物临床试验批件。

地黄生长周期较长，且易受生长环境的影响，连续种植的地黄，地下根茎多为须根，无法形成膨大的具备要用价值的块茎，只能间隔8-10年后才能种植。连作障碍已经成为制约地黄种植生产亟待解决的难题。河南焦作是怀地黄的道地产区，随着种植面积的不断增加，较多地区出现无新地可供种植，轮作年限严重缩短的情况，严重制约了地黄的产量及质量。此外，地黄植物中梓醇含量较低(1吨干重的熟地黄中仅能提取得到2g的梓醇)，化学组分复杂，提取分离纯化的成本较高。

19世纪30年代，科学家首次建立了离体培养植物细胞的培养技术。经过80年的发展，植物生物技术得到了长足的发展，利用植物细胞培养技术生产重要活性次生代谢产物得到越来越多科学家的关注，并已有一些成功实现工业化生产的案例，如利用生物反应器技术悬浮培养红豆杉脱分化细胞可工业化生产紫杉醇，利用悬浮培养的黄连脱分化细胞可工业化生产小檗碱，利用悬浮培养的彩叶草脱分化细胞可工业化生产迷迭香酸等。

当前所使用的植物细胞培养技术多以离体的茎、根、叶等为细胞来源，这种方式获得的细胞均为脱分化细胞。在离体细胞的获得过程中，细胞易发生有害的表观遗传变异和基因变异或缺失，经过长期培养后细胞生长变慢，次生代谢产物的种类和含量逐渐下降。因此，建立遗传信息稳定，经长期培养后仍然保持较高的生长速率和较高产量次生代谢产物的细胞培养体系是植物细胞培养亟待解决的首要问题。

植物干细胞是一种原始的、未分化的，具有全能性或多能性的细胞，它可以分化成多种细胞类型或组织器官。植物干细胞为根、茎和叶等器官的形成及再生源源不断的提供新细胞，并贯穿植物的整个生命周期。植物干细胞存在于植物的茎顶端分生组织、根尖分生组织和维管形成层。植物维管束形成层为干细胞提供小生境，并维持多能干细胞的数量和功能。

2010年，韩国云火科学院的科学家从野生的红豆杉枝条中分离培养了红豆杉形成层分生组织细胞，经稳定化培养后获得红豆杉干细胞培养体系，其紫杉醇含量高达264mg/kg，并可实现3吨规模的工业化生产。利用现有的植物细胞培养技术获得的地黄脱分化细胞梓醇含量较低，且不能长期稳定的用于工业化生产活性次生代谢产物。

发明内容

为解决目前地黄脱分化细胞梓醇含量较低的缺陷，本发明的目的在于提供一种利用悬浮培养的地黄茎形成层干细胞长期稳定生产梓醇的方法，该方法具有生产周期短、环境友好、可持续性强、产量高且稳定等特点。

本发明提供的利用悬浮培养的地黄茎形成层干细胞生产梓醇的方法，具体包括如下步骤：

S1：以地黄属植物茎为外植体，对外植体进行灭菌，通过诱导培养、分离培养和继代培养建立稳定生长的地黄茎形成层干细胞培养体系；