[发明专利]利用悬浮培养的地黄茎形成层干细胞生产梓醇的方法

权利要求书

1.一种利用悬浮培养的地黄茎形成层干细胞生产梓醇的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

S1：以地黄属植物茎为外植体，对外植体进行灭菌，通过诱导培养、分离培养和继代培养建立稳定生长的地黄茎形成层干细胞培养体系；

S2：将地黄形成层干细胞培养体系于生物反应器中进行悬浮培养，向悬浮培养基中加入联合诱导子甲基-β-环糊精和茉莉酸甲酯刺激梓醇的累积；

S3：收集经S2悬浮培养的培养物，进行冷冻干燥，得到冻干粉，采用70～95％的乙醇溶液对所述冻干粉进行超声提取数次，过滤并合并提取液后于低温减压浓缩得浸膏I；

S4：将S3所得浸膏I用适量无水乙醇溶解后，形成粗提液，对粗提液进行大孔树脂吸附，然后用不同浓度的乙醇进行梯度洗脱，合并洗脱液后低温减压浓缩得浸膏II；

S5：采用高效液相制备柱对S4所得浸膏II进行精制得到高纯度的梓醇。

2.根据权利要求1所述的利用悬浮培养的地黄茎形成层干细胞生产梓醇的方法，其特征在于，所述地黄属植物包括天目地黄Rehmannia chingii Li、高地黄Rehmannia elataN.E.Brown、地黄Rehmannia glutinosa(Gaetn.)Libosch.ex Fisch.et Mey.、湖北地黄Rehmannia henryi N.E.Brown、裂叶地黄Rehmannia piasezkii Maxim、茄叶地黄Rehmannia solanifolia Tsoong et Chin。

3.根据权利要求1所述的利用悬浮培养的地黄茎形成层干细胞生产梓醇的方法，其特征在于，S1中，所述稳定生长的地黄形成层干细胞培养体系是通过如下方法建立得到的：

1)取新鲜采摘的野生地黄茎部，清洗后切成含有维管束的木质部、韧皮部和形成层的小块作为外植体；

2)使用灭菌水对步骤1)处理后的外植体进行灭菌冲洗，再使用至少一种灭菌剂进行灭菌处理后，杀死外植体表面和内部的内生真菌，然后用无菌水冲洗3～5次，获得表面无菌的外植体；

3)将经步骤2)灭菌处理后的外植体置于诱导培养基中诱导培养5～15天，维管束形成层干细胞和脱分化细胞快速分裂生长，形成明显的细胞团后置于分离培养基中培养3～12天，直至维管束形成层干细胞从外植体中剥离开，与脱分化细胞相互发生分层现象；

所述诱导培养基的配方为：添加有10～20g/L蔗糖、1.5～4.5g/L结冷胶和1.5～3.5mg/L 6-苄氨基腺嘌呤的WPM基础培养基或MS基础培养基，培养基pH值为5.5～6.0；

所述分离培养基的配方为：添加有10～25g/L蔗糖、1.0～4.0g/L结冷胶、1.0～3.0mg/L6-苄氨基腺嘌呤的WPM基础培养基或MS基础培养基，培养基pH值为5.0～6.0；

4)将步骤3)中发生分层的细胞转移至继代培养基中培养10～20天，然后再转移至新鲜的生长培养基中10～20天，如此重复连续继代培养后获得能稳定生长的地黄形成层干细胞培养体系；

所述继代培养基的配方为：添加有10～25g/L蔗糖、1.0～4.0g/L结冷胶、0.4～0.8g/L活性炭、0.5～3.0mg/L NAA和0.5～3.0mg/L 6-BA的WPM基础培养基或MS基础培养基，培养基pH值为5.0～6.0。

4.根据权利要求3所述的利用悬浮培养的地黄茎形成层干细胞生产梓醇的方法，其特征在于，步骤3)中的诱导培养和分离培养，以及步骤4)中的继代培养的培养条件均为：

温度22～28℃，湿度60～80％，光照来源为LED白光灯，光照强度2200～3200lx，光照时间为12～16h。