[发明专利]CRISPR-Cas9系统特异性靶向人RSPO2基因的sgRNA及敲除方法和应用

说明书

本发明公开了一种CRISPR‑Cas9系统特异性靶向人RSPO2基因的sgRNA及敲除方法和应用，属于生物技术领域。本发明的目的应用CRISPR‑Cas9系统特异性敲除人RSPO2基因，抑制Wnt/β‑catenin信号通路并使活化的肝星状细胞回退到静止状态或凋亡，从而有效促进肝纤维化的恢复过程。本发明设计、合成了一组特异性靶向RSPO2基因的sgRNA，将该sgRNA连接至慢病毒载体，并包装成慢病毒，能在细胞内稳定的转录生产sgRNA，可以发挥长期抑制靶基因表达的作用。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及CRISPR-Cas9系统中特异性靶向人RSPO2基因的sgRNA及敲除方法和应用。

背景技术

规律成簇间隔短回文重复系统(CRISPR-Cas9)广泛存在于细菌和古细菌中，是由RNA介导、可遗传的获得性免疫系统。CRISPR(Clustered Regularly Interspaced ShortPalindromic Repeats)由高度保守的重复序列(repeats)和多个不同的间隔序列(spacer)顺序排列组成，重复序列长度通常21～48bp，重复序列之间被26～72bp的间隔序列隔开。Cas9(CRISPR associated)是一种双链DNA核酸酶，拥有两个结构域：①HNH-like结构域切割与crRNA(CRISPR RNA)互补的DNA链，②RuvC-like结构域切割非互补链。CRISPR-Cas9的基本机制为：①CRISPR序列转录并加工成crRNA，②tracrRNA(trans-activating crRNA)招募Cas9蛋白，③crRNA的间隔序列与与目标序列的PAM(Protospacer Adjacent Motif)邻近靶序列配对，Cas9蛋白双酶切活性被激活从而在靶位点处引起双链断裂(double-strandedbreaks DSB)，断裂的双链DNA通过非同源末端直接连接(nonhomologous end joining，NHEJ)或者同源重组(homology-directedrepair，HDR)进行修复。修复后的DNA由于碱基的随机插入或删除引起移码突变从而抑制基因的表达，这就实现了在DNA水平上对基因进行定向敲除

CRISPR特异性编辑靶序列是通过crRNA和tracrRNA和靶序列互补识别实现的。现已将tracrRNA与crRNA表达为一条嵌合的向导RNA(single guide RNA，sgRNA)，将CRISPR-Cas9系统简化为Cas9蛋白和sgRNA两个组分，使得CRISPR-Cas9系统具有构建简单、效率高、成本低廉等优点，是基因组编辑技术最合适的选择。为防止脱靶和错误靶向，设计精准靶向目标序列的sgRNA是CRISPR-Cas9系统的关键技术。

肝纤维化是肝脏对各种原因所致慢性肝损伤的创伤愈合反应，导致肝小叶内和汇管区大量纤维组织增生和沉淀，病理学特点是以胶原蛋白为主的细胞外基质各种成分合成增多，降解相对不足，但并未形成小叶内间隔，如进一步发展则进入肝硬化。肝纤维化是可逆的过程，对肝纤维化的预防和早期干预是稳定病情、阻止肝纤维化向肝硬化和肝癌发展的最佳措施。

肝星状细胞是肝脏合成细胞外基质的主要细胞，其激活发生肌成纤维细胞的表型转换是肝纤维化发生的中心环节。肝星状细胞的激活受众多信号通路的调控，现有研究结果证实Wnt信号通路影响肝星状细胞的活化，阻断Wnt信号通路可抑制肝星状细胞的增殖及诱导其凋亡。但Wnt信号通路参与了多种生物学过程，包括细胞形态与功能的分化及维持、免疫、细胞癌变与凋亡，直接阻断该信号通路可能具有广泛的不良生物学效应。R-脊椎蛋白2(RSPO2)是新发现的Wnt信号通路的重要调控因子，RSPO2可以激活并增强Wnt/β-catenin信号通路，在生物体的组织分化、器官形成以及疾病发生过程中发挥重要作用。

在肝纤维化治疗的研究中，如何不直接阻断Wnt等重要信号通路而达到调控的肝星状细胞活化的目的，是一个亟待解决的重要问题。