[发明专利]一种用于流感病毒的有限复制型黏膜免疫疫苗

权利要求书

1.一种制备流感病毒疫苗的方法，包括如下步骤：

（1）将重组病毒感染MDCK细胞，培养后收集上清，即F1代病毒液；

（2）F1代病毒液感染MDCK细胞，培养后收集上清，即F2代病毒液；

（3）F2代病毒液感染MDCK细胞，培养后收集上清，即F3代病毒液；

（4）将F3代病毒液作为流感病毒疫苗的活性成分；

所述重组病毒为如下（a）或（b）：

（a）一种重组病毒，是将流感病毒基因组中编码NS1蛋白的两个氨基酸残基的密码子进行如下突变得到的重组病毒：第38位氨基酸残基的密码子由精氨酸密码子突变为丙氨酸密码子，第41位氨基酸残基的密码子由赖氨酸密码子突变为丙氨酸密码子；

（b）一种重组病毒，其制备方法包括如下步骤：

将质粒pHH21-PA、质粒pHH21-PB1、质粒pHH21-PB2、质粒pHH21-HA、质粒pHH21-NP、质粒pHH21-NA、质粒pHH21-M、质粒pHH21-NS1R38A/K41A、质粒pcDNA3.0-PA、质粒pcDNA3.0-PB1、质粒pcDNA3.0-PB2和质粒pcDNA3.0-NP共转染离体哺乳动物细胞后进行培养得到的重组病毒；

pHH21-PA为在载体pHH21的多克隆位点插入序列表的序列3所示的双链DNA分子得到的重组质粒；质粒pHH21-PB1为在载体pHH21的多克隆位点插入序列表的序列4所示的双链DNA分子得到的重组质粒；质粒pHH21-PB2为在载体pHH21的多克隆位点插入序列表的序列5所示的双链DNA分子得到的重组质粒；质粒pHH21-HA为在载体pHH21的多克隆位点插入序列表的序列6所示的双链DNA分子得到的重组质粒；质粒pHH21-NP为在载体pHH21的多克隆位点插入序列表的序列7所示的双链DNA分子得到的重组质粒；质粒pHH21-NA为在载体pHH21的多克隆位点插入序列表的序列8所示的双链DNA分子得到的重组质粒；质粒pHH21-M为在载体pHH21的多克隆位点插入序列表的序列9所示的双链DNA分子得到的重组质粒；质粒pHH21-NS1R38A/K41A为将编码突变蛋白的基因插入载体pHH21的多克隆位点得到的重组质粒；质粒pcDNA3.0-PA为在载体pcDNA3.0的多克隆位点插入序列表的序列3所示的双链DNA分子得到的重组质粒；质粒pcDNA3.0-PB1为在载体pcDNA3.0的多克隆位点插入序列表的序列4所示的双链DNA分子得到的重组质粒；质粒pcDNA3.0-PB2为在载体pcDNA3.0的多克隆位点插入序列表的序列5所示的双链DNA分子得到的重组质粒；质粒pcDNA3.0-NP为在载体pcDNA3.0的多克隆位点插入序列表的序列7所示的双链DNA分子得到的重组质粒；

所述突变蛋白，是将流感病毒的NS1蛋白进行如下两个氨基酸残基的突变得到的：第38位氨基酸残基由精氨酸突变为丙氨酸，第41位氨基酸残基由赖氨酸突变为丙氨酸。

2.一种制备流感病毒疫苗的方法，包括如下步骤：

（1）将权利要求1中所述的重组病毒感染MDCK细胞，培养后收集上清，即F1代病毒液；

（2）F1代病毒液感染A549细胞，培养后收集上清，即F2代病毒液；

（3）将F2代病毒液作为流感病毒疫苗的活性成分。

3.权利要求1或2所述方法制备得到的流感病毒疫苗。