[发明专利]一种类泛素底物融合蛋白及制备方法和医用用途

说明书

本发明公开一种类泛素底物融合蛋白及制备方法和医用用途，提供了一种新的NEDD8修饰融合蛋白，解决了PLA2在大肠杆菌不溶性表达的技术难题；利用pColdTF冷诱导表达载体高效制备融合蛋白Strep tagⅡ‑NEDD8‑PLA2，克服现有方法中PLA2蛋白表达量低、表达产物以包涵体形式存在给后续纯化带来诸多不便，以及表达产物的反应原性和免疫原性不如可溶性蛋白好等缺陷。

技术领域

本发明属于生物技术领域，提供一种类泛素底物融合蛋白及制备方法，尤其是一种融合蛋白Strep tagⅡ-NEDD8-PLA2及制备方法，本发明还提供了该NEDD8修饰融合蛋白的医用用途。

背景技术

本发明涉及的NEDD8（neural precursor cell-expressed developmentallydownregulated 8）是由81个氨基酸编码的蛋白质，它和泛素具有很高的相似性，NEDD8最初的报道是在小鼠胚胎的脑组织中高度富集的新的mRNA，RNA印迹实验表明NEDD8在发育过程中表达下调。在成人组织中NEDD8在心脏和骨骼肌中特异性表达。而且NEDD8的结构已经被解析出来，总体结构与泛素相似，主要的区别仅在两者表面区域具有不同的静电势能面，所以与其他发现的类泛素分子相比，NEDD8的结构与泛素是最为接近的，大多数真核生物(植物、动物、真菌) 中 NEDD8 高度保守，因此 NEDD8 在真核细胞中具有十分重要的功能。类泛素蛋白的翻译后修饰已经被证实参与几乎所有细胞内的调控过程，如细胞周期、信号传导、免疫识别、细胞凋亡、细胞增殖与分化、蛋白质转运、器官起源、炎症、抗原呈递、内质网调控、DNA 修复以及应激反应等，而制备出高灵敏的底物及分析方法是进行相关研究的关键。

磷脂酶A2（PhospholipaseA2,PLA2）是一类广泛存在的催化磷脂二位酰基(sn-2)水解的酶族。因PLA2能水解甘油磷脂类的sn-2位酯键的特点，许多人工sn-2位连接荧光基因的脂类是PLA2活性的方便灵敏的产物，但PLA2的活性受其N端序列空间位阻的影响，利用此特点，本发明的任务是：将鸡的NEDD8分子融合于PLA2的N端，应用原核表达纯化出StreptagⅡ-NEDD8-PLA2蛋白，此时融合的PLA2无水解底物活性，当去NEDD8修饰酶水解除去PLA2的N端NEDD8分子解除空间位阻，使PLA2活性，水解人工脂类底物，从而用来分析去NEDD8修饰酶的活性。

发明内容

本发明公开一种类泛素底物融合蛋白，为融合蛋白Strep tagⅡ-NEDD8-PLA2，克服了PLA2在大肠杆菌不溶性表达的技术难题。

本发明进一步提供了NEDD8修饰融合蛋白的制备方法，利用pColdTF冷诱导表达载体高效制备融合蛋白Strep tagⅡ-NEDD8-PLA2，克服现有方法中PLA2蛋白表达量低、表达产物以包涵体形式存在给后续纯化带来诸多不便，以及表达产物的反应原性和免疫原性不如可溶性蛋白好等缺陷。

本发明又提供了NEDD8修饰融合蛋白的医用用途，在体外系统中检测去NEDD8修饰酶活性，并且公开了此蛋白作为去NEDD8修饰酶底物的使用方法，用于制备人、哺乳动物及去NEED8修饰酶类的活性分析检测试剂盒。

本发明的目的在于提供一种利用pColdTF表达载体高效表达PLA2蛋白的方法，该方法能够高效表达可溶性的NEDD8融合的PLA2蛋白，并且表达产物的免疫学反应活性更佳；本发明提供一种Strep tagⅡ-NEDD8-PLA2融合基因的获取方法；本发明进一步提供了融合蛋白Strep tagⅡ-NEDD8-PLA2的原核表达质粒的构建、融合蛋白Strep tagⅡ-NEDD8-PLA2的原核表达、纯化及功能验证等详细方法；此外还应用融合蛋白Strep tagⅡ-NEDD8-PLA2分析去NEDD8修饰酶的活性。

本发明所述的一种优化合成的鸡NEDD8基因，其序列如SEQ no.1所示。