[发明专利]一种类泛素底物融合蛋白及制备方法和医用用途

权利要求书

1. 一种优化合成的鸡NEDD8基因，其序列如SEQ no.1所示。

2.一种含有可编码Strep tagⅡ-NEDD8-PLA2融合蛋白的基因序列，其序列如SEQ no.2所示。

3.如权利要求2所述的融合蛋白Strep tagⅡ-NEDD8-PLA2基因的获取方法，包括以下步骤：

1）鸡NEDD8融合基因的获取

根据Genbank#XP_015129231.1蛋白序列，设计合成了NEDD8基因，优化了基因序列的GC含量、重复序列、密码子偏好性、mRNA二级结构，并在其N端依次添加NdeⅠ酶切位点、肠激酶切识别位点、Strep tagⅡ标签、KpnⅠ酶切位点，在C端添加AgeⅠ酶切位点，形成SEQ no.1所示的基因序列，进行人工合成并连接到pUC57质粒，形成重组质粒pUC57-NEDD8；应用NdeⅠ和AgeⅠ双酶切pUC57-NEDD8质粒，回收小片段即为所需的鸡NEDD8融合基因；

2）PLA2-基因的获取

根据Genbank#NP_036117.1蛋白序列，合成一段编码该蛋白的第29氨基酸到第151位氨基酸的基因序列，并且在N端添加一个甘氨酸，应用AgeI和XhoI双酶切回收PLA2基因片段；

3）将上述得到的两个片段在T4 DNA Ligase作用下连接，即得到融合蛋白Strep tagⅡ-NEDD8-PLA2基因。

4. 如权利要求2所述的融合蛋白Strep tagⅡ-NEDD8-PLA2的制备，其序列如SEQ no.3所示，包括以下步骤：

1）pColdTF表达质粒用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后，凝胶回收大片段；与权利要求3得到的目的基因片段连接，获得重组表达质粒pColdTF-Strep tagⅡ-NEDD8-PLA2；

2) 将融合蛋白原核表达质粒pColdTF-Strep tagⅡ-NEDD8-PLA2导入到BL21（DE3）原核表达菌体系，37℃终浓度0.1mM IPTG诱导表达载体蛋白；非变性条件下，Ni亲和层析，然后应用肠激酶进行酶切，再应用Strep-Tactin琼脂糖凝胶纯化Strep tagⅡ-NEDD8-PLA2融合蛋白。

5. 如权利要求3所述的融合蛋白Strep tagⅡ-NEDD8-PLA2作为去类泛素化酶底物，在制备人、哺乳动物及去NEED8修饰酶类的活性分析检测试剂盒中的用途。