[发明专利]一种用于分析去Ufm1酶的底物及制备方法与医用用途

说明书

本发明提供一种用于分析去Ufm1酶的底物及制备方法，还提供了该融合蛋白的医用用途，利用PLA2活性均有增高并介导一系列病理生理过程，同时PLA2的N端阻隔影响其活性的现象很明显的特性，将鸡的Ufm1蛋白分子融合与PLA2的N端，在经待检测的去泛素化酶的水解反应后，PLA2的N端解除空间位阻，使其恢复催化活性，水解人工脂类底物，从而能被用以间接分析去泛素化酶UFSP1与UFSP2的活性。本发明是一种新的融合蛋白，可以作为去Ufm1化酶的检测底物。

技术领域：

本发明提供一种用于分析去Ufm1酶的底物及制备方法，还提供了该融合蛋白的医用用途，属于生物技术领域。

背景技术：

Ufm1(Ubiquitin Fold1 Modifier1)，即泛素折叠修饰因子1。Ufm1是一类小分子泛素蛋白，由85个氨基酸组成。和其它泛素蛋白的氨基酸相比，其在C端的去泛素化酶位点为一个丝-甘氨酸二肽结构，而其它反诉类蛋白为双甘氨酸二肽结构。这样的结构保证了Ufm1在发挥生物学功能时的多变与灵活性。Ufm1及其系统在分泌蛋白的细胞中表达最为丰富，如胰腺腺泡与唾液腺等。其在细胞中经Uba5激活后，被转移到Ufc1和Ufl1，随后结合至靶蛋白，辅助靶蛋白的加工修饰。目前发现的靶蛋白有C20 or f116、CDK5RAP3/LZAP、微粒体三酰甘油转运蛋白等、X盒结合蛋白1 (Xbp1)等，但其生物学功能大多未知。

Ufm1的特异性去泛素化酶为UFSP1与UFSP2。其中UFSP1在禽类中不存在。UFSP1与2的区别在于UFSP2的N端有一个能将其引导至高尔基体的结构域，可能与Ufm1修饰过程的结束有非常紧密的关系。因此，为UFSP1与UFSP2去泛素化酶提供一种高灵敏度的检测方法对Ufm1蛋白级联反应与其生理作用的研究有非常重要的作用。

发明内容：

本发明提供一种Ufm1-PLA2融合蛋白，作为去泛素化酶UFSP1与UFSP2的检测底物。

本发明进一步提供Ufm1-PLA2融合蛋白基因序列的获得方法。

本发明进一步提供Ufm1-PLA2融合蛋白原核表达载体的构建方法。

本发明进一步提供Ufm1-PLA2融合蛋白表达纯化的方法。

本发明所述的一种去泛素化酶底物UFM1-PLA2，其基因序列如下：Seq no.2。

本发明所述的去泛素化酶底物UFM1-PLA2的全长基因序列获取方法，包括以下步骤：

1）设计5’端带有Strep tagII的UFM1基因序列，在5’与3’端分别添加NdeI与AgeI酶切位点，并委托进行基因合成，之后使用NdeI与AgeI双酶切质粒，凝胶回收相应片段获得Ufm1序列，其序列如下：Seq no.1；

2）将酶切位点AgeI和XhoI之间的PLA2序列（来源于NCBI，NM_011987.3，使用其657至1028的成熟序列部分，并在其5’端加入GGA）用AgeI与XhoI双酶切并回收相应片段获得PLA2序列；

3）将获得的5’端带有Strep tagII的UFM1基因序列、PLA2序列相连接，获得带有StreptagII去泛素化酶底物UFM1-PLA2的基因序列。

本发明所述的一种融合蛋白UFM1-PLA2，其氨基酸序列如下：Seq no.3。

本发明所述的融合蛋白UFM1-PLA2的制备方法，包括以下步骤：

（1）原核表达质粒构建

pColdTF表达质粒经NdeI与XhoI双酶切后，凝胶回收大片段；

将已获得的UFM1-PLA2序列与表达质粒片段连接，获得将UFM1-PLA2构建入pCold表达载体中的重组质粒，即UFM1-PLA2表达质粒；