[发明专利]一种用于分析去Ufm1酶的底物及制备方法与医用用途

权利要求书

1.一种去泛素化酶底物UFM1-PLA2，其基因序列如下：Seq no.2。

2.根据权利要求1所述的去泛素化酶底物UFM1-PLA2的全长基因序列获取方法，包括以下步骤：

（1）设计5’端带有Strep tagII的UFM1基因序列，在5’与3’端分别添加NdeI与AgeI酶切位点，并委托进行基因合成，之后使用NdeI与AgeI双酶切质粒，凝胶回收相应片段获得Ufm1序列，其基因序列如下：Seq no.1；

（2）将酶切位点AgeI和XhoI之间的PLA2序列用AgeI与XhoI双酶切并回收相应片段获得PLA2序列；

（3）将获得的5’端带有Strep tagII的UFM1基因序列、PLA2序列相连接，获得带有StreptagII去泛素化酶底物UFM1-PLA2的基因序列。

3. 一种融合蛋白UFM1-PLA2，其氨基酸序列如下：Seq no.3。

4. 如权利要求3所述的融合蛋白UFM1-PLA2的制备方法，包括以下步骤：

（1）原核表达质粒构建

pColdTF表达质粒经NdeI与XhoI双酶切后，凝胶回收大片段；

将已获得的UFM1-PLA2序列与表达质粒片段连接，获得将UFM1-PLA2构建入pCold表达载体中的重组质粒，即UFM1-PLA2表达质粒；

（1）融合蛋白UFM1-PLA2的原核表达

将构建完成的pColdTF-UFM1-PLA2重组质粒，转入到BL21（DE3）原核表达菌体系，16℃下以终浓度0.05mM/L IPTG诱导表达融合蛋白；

（3）UFM1-PLA2融合蛋白原核表达产物纯化

非变性条件下，Ni2+亲和层析一步法纯化融合蛋白TF-UFM1-PLA2，利用不同浓度的咪唑对融合蛋白UFM1-PLA2进行洗脱纯化；

再次使用strep tactin亲和层析，用2.5mM/L脱硫生物素洗脱，透析后分装冻存即可。

5.如权利要求3所述的UFM1-PLA2融合蛋白作为去泛素化酶底物中的用途。