[发明专利]精子活性氧类物质定量测定试剂盒及其用途和使用方法

权利要求书

1.一种活性氧定量检测试剂盒，其特征在于，包括氯化硝基四氮唑蓝冻干粉、氯化硝基四氮唑蓝溶解液、显色剂A、显色剂B、标准品；

所述氯化硝基四氮唑蓝冻干粉是浓度为0.1～1mmol/L的氯化硝基四氮唑蓝药液冷冻干燥后的粉末；所述氯化硝基四氮唑蓝溶解液是浓度为0.01～0.5mol/L、pH为7.2～7.6的磷酸盐缓冲液；所述显色剂A是浓度为0.01～0.3mol/L的弱酸性缓冲液；所述显色剂B是0.01％～2％三乙醇胺溶液；所述标准品为含有已知浓度为0～36mmol/L的过氧化氢溶液。

2.根据权利要求1所述的一种活性氧定量检测试剂盒，其特征在于，还包括微孔板条；所述氯化硝基四氮唑蓝冻干粉为分装于密封容器的多瓶，所述显色剂A、显色剂B、标准品分别独立装于瓶中。

3.根据权利要求1或2所述的一种活性氧定量检测试剂盒，其特征在于，所述显色剂A为碳酸氢钠溶液或醋酸钠或磷酸二氢钾或柠檬酸缓冲液。

4.根据权利要求3所述的一种活性氧定量检测试剂盒，其特征在于，所述氯化硝基四氮唑蓝药液的浓度为0.212mmol/L；所述氯化硝基四氮唑蓝溶解液是浓度为0.05mol/L的磷酸盐缓冲液；所述显色剂A是浓度为0.25mol/L的碳酸氢钠溶液；所述显色剂B的浓度是1.62％的三乙醇胺溶液；所述标准品是浓度为36mmol/L的过氧化氢溶液。

5.一种活性氧定量检测试剂盒的用途，其特征在于，用于检测成年男性精子活性氧类物质的含量。

6.一种使用权利要求1所述活性氧定量检测试剂盒检测精子活性氧的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一，将所取新鲜精液标本进行前处理，精子浓度记为M×10⁶/mL；

步骤二，将氯化硝基四氮唑蓝溶液分为两大组，第一组加入精液浓度为M的洗涤精液标本，第二组分别依次加入多个已知过氧化氢浓度C_标准的标准品，混匀；其中，氯化硝基四氮唑蓝溶液与洗涤精液标本的体积比为1～10。

步骤三，将所述步骤一中所得第一组和第二组反应液在10～40℃温度下反应1min，分别读取第一组和第二组的反应液在630nm波长下的第一次吸光度；然后，反应液在10～40℃温度下继续反应10～120min；

步骤四，在所述步骤二中所得第一组和第二组反应液内分别加入显色剂A，混匀；其中，显色剂A与洗涤精液标本的体积比为0.2～3。

步骤五，在所述步骤三中所得第一组和第二组反应液内加入显色剂B，混匀；其中，显色剂B与去洗涤精液标本的体积比为0.2～3。

步骤六，将所述步骤四中所得第一组和第二组反应液在10～40℃温度下反应1min，分别读取第一组和第二组的反应液在630nm波长下的第二次吸光度；然后，反应液在10～40℃温度下继续反应10～120min；

步骤七，分别以第一组和第二组的第二次吸光度减去各自的第一次吸光度，分别记为精液标本中参与反应的活性氧吸光度△A_标本和标准品中参与反应的活性氧吸光度△A_标准；

步骤八，计算得出精子活性氧的水平C_标本。

7.根据权利要求6所述一种检测精子活性氧的方法，其特征在于，所述步骤二中，所述标准品是使用浓度为36mmol/L的过氧化氢溶液和纯水配制成浓度为0、2.25mmol/L、4.5mmol/L、9mmol/L、18mmol/L、36mmol/L的六个标准品。

8.根据权利要求6所述一种检测精子活性氧的方法，其特征在于，所述步骤三或步骤六中，反应液的反应温度是37℃；读取吸光度数值后，反应液在37℃温度下继续反应45min。

9.根据权利要求6所述一种检测精子活性氧的方法，其特征在于，所述氯化硝基四氮唑蓝溶液与洗涤精液标本的体积比为2；所述氯化硝基四氮唑蓝溶液与标准品的体积比为10；所述显色剂A与洗涤精液标本的体积比为0.6；显色剂B与去洗涤精液标本的体积比为0.6。

10.根据权利要求6所述一种检测精子活性氧的方法，其特征在于，所述步骤八中，分别得到六个标准品相应的△A_标准拟合成校准曲线，读取△A_标本的值在校准曲线上对应的浓度值并除以标本的稀释倍数，即为精子活性氧的水平C_标本；精子ROS量＝精子ROS浓度÷精子浓度。