[发明专利]功能化温度敏感型聚合物及其制备方法与在（PTM）蛋白质检测中的应用

说明书

本发明公开了功能化温度敏感型聚合物及其制备方法与在(PTM)蛋白质检测中的应用。该功能化温度敏感型聚合物的结构式如式Ⅰ所示：式Ⅰ中，R为CH₂，r值为0或1，m为20～750之间的任意自然数，n为110～1120之间的任意自然数；为辣根过氧化物酶单元。本发明的功能化温度敏感型聚合物是通过自由基聚合反应得到的带有大量可修饰位点的线型聚合物，经功能化修饰后可得到携带多个HRP和大量三苯基磷基团的温度敏感型聚合物。与传统方法中使用只携带单个HRP的抗体策略相比，HRP和三苯基磷基团数量的增加可有效提高其与叠氮标记目标蛋白的结合能力以及化学发光的信号放大效果。

技术领域

本发明涉及功能化温度敏感型聚合物及其制备方法与在(PTM)蛋白质检测中的应用，属于分析技术领域。

背景技术

蛋白质免疫印迹法(Western Blot，WB)是一种检测复杂生物样本中蛋白质表达与分布的分析技术，已在生物学研究中广泛应用数十年，可以进行定性及半定量分析，是现代生物医学、生物化学及免疫遗传学等领域研究的有力工具。在此技术中，目标蛋白通过SDS-PAGE分离并转移到PVDF膜，使用抗体进行孵育识别目标蛋白，并通过抗体连接酶(例如辣根过氧化物酶(HRP))与底物进行化学发光反应，从而显色产生颜色信号达到检测目的。传统的WB技术是基于抗体对目标蛋白的特异性识别进行检测，因此WB检测的特异性和灵敏度主要依赖于抗体的质量和所连接HRP的性能。在WB检测中抗体可能会对其他非目标蛋白产生非特异性吸附而出现假阳性结果，而且抗体本身存在制备周期长和批次不稳定等缺点，特别是针对蛋白质翻译后修饰 (Post-translational modifications，PTMs)的WB检测仍然存在很多难点。PTMs是指在蛋白质的不同氨基酸侧链发生的各种动态化学修饰，参与各种细胞进程并对蛋白质进行功能调控，修饰种类和修饰含量的异常与多种人类重大疾病密切相关，因此深入检测分析PTMs能够为疾病的发生发展研究、疾病诊断标志物的发现提供有意义的靶点信息。但因其种类繁多且丰度普遍较低，对其分析手段提出了严峻的挑战。研究发现在使用抗体进行蛋白质PTMs的WB分析时，抗体往往对蛋白质的氨基酸序列和结构域存在一定依赖和偏性，难以高特异性的识别和分辨体积较小的PTMs，例如磷酸化修饰或O-GlcNAc糖基化修饰等。此外，对于糖基化修饰或精氨酸/组氨酸磷酸化修饰，因其免疫原性差或高度不稳定，开发抗体本身就极具挑战，因此极大的限制了 WB技术在PTMs研究中的应用。同时抗体所连接的HRP数量少，信号放大倍数有限，因此其检测灵敏度较差。近年来针对这些问题也发展了以纳米颗粒、石墨烯氧化物等作为固相载体固载多种抗体并连接大量HRP以增强其化学发光信号，从而提高WB 灵敏度的策略。然而在孵育时固载在不溶性载体上的抗体与PVDF膜上的目标蛋白形成异相反应体系，导致显著的界面传质阻力、非线性反应动力学以及空间位阻，从而限制了WB的检测灵敏度和定量精度。因此，针对WB技术，迫切需要发展针对目标蛋白新的识别机制和信号放大策略。

发明内容

本发明的目的是提供功能化温度敏感型聚合物及其制备方法与在(PTM)蛋白质检测中的应用，通过自由基聚合反应和化学修饰三苯基磷基团和HRP的方式制备得到功能化温度敏感型聚合物，利用该聚合物的温度响应特性能够实现高特异性和高灵敏度的叠氮标记(PTM)蛋白质WB检测。

本发明提供的功能化温度敏感型聚合物，其结构式如式Ⅰ所示：

式Ⅰ中，R为CH₂，r值为0或1，m为20～750之间的任意自然数，n为110～1120 之间的任意自然数；为辣根过氧化物酶单元。

在本发明的实施例中，式Ⅰ所示聚合物具体可为下述式Ⅰ-A所示聚合物，

式Ⅰ-A中，m为20～750之间的任意自然数，n为110～1120之间的任意自然数；为辣根过氧化酶单元。