[发明专利]功能化温度敏感型聚合物及其制备方法与在（PTM）蛋白质检测中的应用

权利要求书

1.一种聚合物，其特征在于：所述聚合物如式Ⅰ所示：

式Ⅰ中，R为CH₂，r值为0或1，m为20～750之间的任意自然数，n为110～1120之间的任意自然数；为辣根过氧化物酶单元。

2.根据权利要求1所述的聚合物，其特征在于：所述聚合物为下述式Ⅰ-A所示聚合物，

式Ⅰ-A中，m为20～750之间的任意自然数，n为110～1120之间的任意自然数；

为辣根过氧化酶单元。

3.权利要求1或2所述的聚合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)在引发剂存在的条件下，温敏单体和功能单体经自由基聚合反应得到式Ⅱ所示温度敏感型聚合物；

所述温敏单体为N-异丙基丙烯酰胺；

所述功能单体为丙烯酸或丁烯酸；

式Ⅱ中，R为CH₂，r值为0或1，m为20～750之间的任意自然数，n为110～1120之间的任意自然数；

(2)式Ⅲ所示辣根过氧化物酶和式Ⅳ所示施陶丁格试剂发生亲核取代反应，得到式Ⅴ所示功能试剂；

(3)式Ⅱ所示温度敏感型聚合物与式Ⅴ所示功能试剂经氨基-羧基偶联反应，得到所述聚合物。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述温敏单体与所述功能单体的摩尔比为1：1～7：1；和/或，

所述引发剂为过硫酸钾、过硫酸铵和过硫酸钠中任一种；所述引发剂的用量为所述温敏单体质量的5％～50％；和/或，

所述自由基聚合反应的温度为50～80℃，时间为8～12小时；和/或，

所述自由基聚合反应在水中进行；和/或，

所述自由基聚合反应在惰性气氛中进行；和/或，

步骤(2)中，式Ⅳ所示施陶丁格试剂与式Ⅲ所示辣根过氧化物酶的比例为(0.5～2)mM：(5～20)mg/mL；和/或，

所述亲核取代反应的温度为20～25℃，时间为0.5～2小时；和/或，

所述亲核取代反应在磷酸盐缓冲液与有机溶剂的混合液中进行；所述有机溶剂为二甲基亚砜或N，N-二甲基甲酰胺；所述磷酸盐缓冲液与所述有机溶剂的体积比为20：1～4：1；和/或，

步骤(3)中，所述温度敏感型聚合物与所述功能试剂的质量比为1：1～1：6；和/或，

所述氨基-羧基偶联反应的温度为20～25℃，时间为2～12小时；和/或，

所述氨基-羧基偶联反应在2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲溶液中进行。

5.权利要求1或2所述的聚合物在温度为33～45℃形成的自组装产物。

6.权利要求1或2所述的聚合物或权利要求5所述的自组装产物在利用蛋白质免疫印迹法对叠氮标记蛋白质或其翻译后修饰分析检测中的应用。

7.利用权利要求1或2所述的聚合物或权利要求5所述的自组装产物采用蛋白质免疫印迹法对叠氮标记蛋白质或其翻译后修饰进行分析检测的方法，其特征在于：所述方法通过所述聚合物中的三苯基磷与所述叠氮标记蛋白质或其翻译后修饰中的叠氮基团之间的施陶丁格连接反应，与吸附于聚偏二氟乙烯膜上的叠氮标记蛋白质或其翻译后修饰进行特异性结合，并利用所述聚合物的温度响应特性导致的自组装行为，实现所述叠氮标记蛋白质或其翻译后修饰的检测分析。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述方法的具体步骤如下：

(1)将叠氮标记蛋白质或其翻译后修饰样品进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并转移到聚偏二氟乙烯膜上，封闭；

(2)将所述聚合物溶解于含有表面活性剂的缓冲溶液中，将其与聚偏二氟乙烯膜接触孵育进行所述施陶丁格连接反应，升高温度使所述聚合物在目标蛋白区域内自组装聚集；

(3)使用所述含有表面活性剂的缓冲溶液清洗聚偏二氟乙烯膜除去非特异性吸附的所述聚合物及其自组装，对清洗后的聚偏二氟乙烯膜进行化学发光检测。