[发明专利]一种体外筛选细胞自噬调节剂的方法

说明书

本发明公开了一种体外筛选细胞自噬调节剂的方法，是以待检测的自噬调节因子作为干预因素，处理稳定表达HA‑SOD1 A4V突变体的HEK293细胞体外评价模型，使用含有Triton X‑100的细胞裂解液裂解处理后体外评价模型，分离出Triton X‑100不溶部分，根据检测的Triton X‑100不溶部分中HA‑SOD1 A4V突变体的表达变化来判定自噬调节因子对细胞自噬的调节作用。本发明所述方法简单直观、准确可靠，能够准确地筛选出细胞自噬调节剂。

技术领域

本发明属于细胞自噬调节剂筛选技术领域，涉及一种用于体外筛选细胞自噬调节剂的实验方法。

背景技术

细胞自噬是真核细胞中维持代谢平衡的关键生理过程。其由多个连续步骤构成：吞噬泡的形成；自噬小体的形成；自噬小体与溶酶体融合形成自噬溶酶体；底物的降解等。细胞自噬失调与多种人类疾病密切相关，因此，筛选高效的细胞自噬调节剂，是寻找自噬失调相关疾病治疗药物的重要途径。

利用Western杂交检测自噬小体标记物LC3的表达，是筛选细胞自噬调节剂的重要手段。但是该方法的应用具有很大的不确定性，很容易造成对结果的误判。例如，诱导或抑制自噬均可能引起LC3表达的升高甚至不发生变化。因此，目前亟需开发一种可以直观、准确筛选自噬调节剂的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种体外筛选细胞自噬调节剂的方法，以能够直观、准确地筛选细胞自噬调节剂。

本发明所述体外筛选细胞自噬调节剂的方法是采用稳定表达HA-SOD1 A4V突变体的HEK293细胞建立用于筛选自噬调节剂的体外评价模型，以待检测的自噬调节因子作为干预因素处理所述体外评价模型，再使用含有Triton X-100的细胞裂解液裂解所述处理后体外评价模型，分离出细胞裂解液中的Triton X-100不溶部分，根据Triton X-100不溶部分中HA-SOD1 A4V突变体的表达变化，判定所述自噬调节因子对细胞自噬的调节作用，筛选出潜在的细胞自噬调节剂。

其中，优选地，所述细胞裂解液中含有1% Triton X-100。

具体地，如果所述自噬调节因子可以抑制Triton X-100不溶部分中HA-SOD1 A4V突变体堆积，则该自噬调节因子为自噬诱导剂；反之，促进Triton X-100不溶部分中HA-SOD1 A4V突变体堆积的自噬调节因子则为自噬抑制剂。

本发明所述体外筛选细胞自噬调节剂的方法采用HEK293细胞作为细胞模型，HEK293细胞是商品化的人胚胎肾细胞株，具有永生化特性，培养方法简单，增殖迅速，是建立体外检测模型的最佳选择。

本发明所述体外筛选细胞自噬调节剂的方法具体是采用离心分离的方式来分离出Triton X-100不溶部分的。Triton X-100是一种非离子性表面活性剂，常用于增加蛋白质的溶解度。本发明利用SOD1 A4V突变体具有不溶于Triton X-100的特性，以及Triton X-100可溶部分与不溶部分沉降系数的差异，采用离心分离的方法进行Triton X-100不溶部分的分离。

更具体地，本发明所述体外筛选细胞自噬调节剂的方法是采用Western杂交来检测Triton X-100不溶部分中HA-SOD1 A4V突变体的表达变化，进而体外筛选细胞自噬调节剂。Western杂交被广泛应用于检测蛋白水平的表达。

本发明利用构建的稳定表达HA-SOD1 A4V突变体的HEK293细胞株，通过比较处理组和空白对照组中Triton X-100不溶部分中的HA-SOD1 A4V突变体表达水平的变化，评价体外条件下处理组自噬调节因子对自噬活性的影响。本发明所述方法简单直观、准确可靠，能够准确地筛选出细胞自噬调节剂。

附图说明

图1是实施例1中雷帕霉素对Triton X-100不溶部分中HA-SOD1 A4V突变体表达水平的影响。