[发明专利]一种同时检测α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白含量的方法

说明书

本发明公开了一种同时检测α‑乳白蛋白、β‑乳球蛋白和乳铁蛋白含量的方法，包括以下步骤：利用生物芯片点样仪在芯片载体上固定α‑乳白蛋白、β‑乳球蛋白和乳铁蛋白，再封闭载体基片上没有结合点样物的活性基团；在生物芯片的部分反应孔内加入α‑乳白蛋白、β‑乳球蛋白和乳铁蛋白的混合标准溶液，在剩余反应孔内分别加入待测样品溶液，继续向所有反应孔中依次加入α‑乳白蛋白、β‑乳球蛋白和乳铁蛋白所对应的抗体和标记二抗，反应后洗涤液洗涤；所有反应孔内加入显色剂，显色反应；反应后终点颜色的深浅可目视定性判断样品中待测物的含量，再使用仪器利用外标曲线定量计算待测物溶液中α‑乳白蛋白、β‑乳球蛋白和乳铁蛋白的含量。本发明方法可以快速准确的同时测定α‑乳白蛋白、β‑乳球蛋白和乳铁蛋白的含量，灵敏度高，检测时间短，操作简单易行。

技术领域

本发明属于蛋白检测方法，特别涉及一种同时检测α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白含量的方法，属于食品分析的免疫分析技术领域。

背景技术

牛乳及其乳制品中含有丰富的蛋白质，几乎含有人体所有的必需氨基酸。在发达国家，乳蛋白及其制品提供了20％-30％的食物蛋白，是人们的重要蛋白质来源。尤其对于婴幼儿来说，牛乳是除了母乳之外的重要营养物质，但是牛乳又是较易引起过敏的食物之一。牛乳过敏对婴幼儿的健康成长已经造成了越来越大的影响，它可以引起婴幼儿腹泻、皮疹、缺铁性贫血、发育不良，严重时甚至可以引起喉头水肿和过敏性休克最终导致死亡。引起牛乳过敏的主要过敏原是乳蛋白，绝大多数牛乳蛋白都具有潜在的致敏性，其中的酪蛋白、P-乳球蛋白、a-乳白蛋白被认为是主要的过敏原。大量的流行病学研究表明，乳蛋白过敏在婴幼儿中最为普遍，发生率大约是2％-6％。据统计，大约有20％的婴儿在1岁时用牛奶喂养都会发生牛奶蛋白过敏。

牛乳中α-乳白蛋白占总乳清蛋白的22％，易溶于水，属于溶菌酶家族，呈球状，由123个氨基酸残基构成，分子量为14.4kDa，含有4个二硫键。牛乳中α-乳白蛋白与人乳中α-乳白蛋白的同源性约为74％，另有6％的氨基酸残基化学性质相似。β-乳球蛋白是乳清中含量最多的蛋白，占乳清蛋白的50％，牛乳总蛋白的10％，在鲜牛乳中以36kDa的二聚体形式存在，属Lipoca1in蛋白，其单体由162个氨基酸残基组成。β-乳球蛋白不存在于母乳中，且胃蛋白酶不能将其消化水解，因此可通过胃肠道进入血液循环。据报道，这一类蛋白具有强致敏性，作为牛乳中的首要过敏成分，刺激婴儿免疫系统的发生超敏反应。乳铁蛋白是一种分子量约为80kD的铁结合糖蛋白，其来源主要是由动物的乳腺上皮细胞分泌。乳铁蛋白是人乳中的4种主要蛋白质之一，大约占人乳总蛋白的10％，它属于一种先天免疫系统的成分物质，可以促进铁元素的吸收，还具有抗菌杀菌、抗病毒及调节机体免疫反应等多种功能。婴儿出生后，自身免疫系统还没有完全健全，母乳中的乳铁蛋白是保证婴幼儿健康生长的一种重要物质，而大部分婴幼儿配方奶粉中几乎不含这种营养物质。在婴幼儿配方奶粉中添加使用牛乳铁蛋白，使其营养成分更接近母乳，对婴幼儿的生长发育极为重要；但是如果摄入过量，又会对婴幼儿的肝肾功能造成负担。

牛乳营养价值高、但致敏性强，而牛乳又常作为原料用于各种食品，所以开展针对食品中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白含量的检测方法具有重要的理论和现实意义。目前，国内外对食品中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白含量的检测方法包括：以检测蛋白为基础的免疫化学检测方法，如酶联免疫吸附法(ELISA)和仪器检测方法高效液相色谱法(HPLC)等。ELISA一次只能检测一种蛋白，无法做到多指标同时检测。HPLC法虽可同时检测多种蛋白但前处理操作繁琐，耗时长，且需要专业的技术人员进行操作，检测成本高。此外，HPLC的检测灵敏度低，乳铁蛋白含量相对较低，无法和α-乳白蛋白、β-乳球蛋白同时检测。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种可同时检测食品中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白含量的方法，在于弥补现有方法无法同时检测α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白含量的空白，满足快速、高灵敏度，低成本检测要求。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：