[发明专利]截短型人刺鼠信号蛋白与穿膜肽的融合蛋白及其制备方法与编码基因

说明书

本发明提供了一种截短型人刺鼠信号蛋白与穿膜肽的融合蛋白，包括截短型人刺鼠信号蛋白序列和穿膜肽序列；其中所述截短型人刺鼠信号蛋白序列和所述穿膜肽序列通过连接肽连接。本发明还提供了制备融合蛋白的方法，包括：制备质粒、转化、多拷贝插入重组子的筛选、发酵和纯化。本发明还提供了融合蛋白的编码基因，包含该编码基因的表达载体、细胞系。

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种截短型人刺鼠信号蛋白与穿膜肽的融合蛋白及其制备方法，本发明还涉及所述融合蛋白的编码基因。

背景技术

刺鼠信号蛋白(Agouti signaling protein,ASIP)由Agouti基因编码,不同物种的Agouti基因及刺鼠信号蛋白有较高的同源性。Agouti基因编码的刺鼠信号蛋白由131个氨基酸构成，包含N端22个氨基酸残基的信号肽和109个氨基酸残基的功能区。

1994年Lu等发现刺鼠相关蛋白(ASIP)与黑皮素受体(MCR)有高度的亲和力，ASIP与α-促黑素(MSH)竞争性和黑皮素受体-1(MC1R)结合，阻滞α-MSH下游的信号传导进而抑制黑素合成。体外黑素细胞培养实验也证实，加入ASIP可拮抗α-MSH，抑制黑素细胞内的cAMP水平升高、抑制酪氨酸酶TRP-1和TRP-2的表达，使黑素细胞合成黑素降低。也有实验表明ASIP在自体移植皮片中能竞争性拮抗α-MSH的黑素合成，使皮片着色能力降低，从而证明皮片移植后表皮细胞中α-MSH的表达上调是皮片呈过度色素沉着的重要原因。从而可以得出结论，ASIP对皮肤颜色的影响主要是通过抑制黑素的合成实现的。

刺鼠信号蛋白具有显著的抑制黑色素生成的活性，在皮肤色素沉着中具有很好的应用潜力，但目前还未见到重组刺鼠信号蛋白表达及应用的报道。

发明内容

本发明的发明目的在于提供一种截短型人刺鼠信号蛋白与穿膜肽的融合蛋白及其制备方法与编码基因。

一方面，本发明提供了一种截短型人刺鼠信号蛋白与穿膜肽的融合蛋白，包括截短型人刺鼠信号蛋白序列和穿膜肽序列；其中所述截短型人刺鼠信号蛋白序列和所述穿膜肽序列通过连接肽连接。

另一方面，本发明提供了前述融合蛋白的制备方法，包括：

(1)制备质粒：人工全基因合成序列表中的SEQ ID No:4的核苷酸序列，对pPIC9K载体及SEQ ID No:4的核苷酸序列进行XhoⅠ和NotⅠ双酶切，回收酶切产物，用DNA连接酶连接，并转化大肠杆菌，提取质粒；

(2)转化：将步骤(1)制备的质粒转化毕赤酵母感受态细胞，获得转化后菌落；

(3)多拷贝插入重组子的筛选：将步骤(2)转化后的菌落进行进一步筛选，获得转化子；

(4)发酵：对步骤(3)获得的转化子进行发酵培养获得发酵液；

(5)纯化：将步骤(4)得到的发酵液依次进行固液分离、过滤、浓缩和离子交换层析得到产品。

另一方面，本发明提供了前述融合蛋白的编码基因。

另一方面，本发明提供了含有前述编码基因的表达载体。

另一方面，本发明提供了含有前述编码基因的细胞系。

另一方面，本发明提供了前述融合蛋白在制备药品中的应用。

另一方面，本发明提供了前述融合蛋白在制备化妆品中的应用。

本发明的截短型人刺鼠信号蛋白与穿膜肽的融合蛋白中的截短型人刺鼠信号蛋白是对天然刺鼠信号蛋白的剪切，选取C端的50个氨基酸，但其仍具有抑制黑色素生成活性；同时在截短型刺鼠信号蛋白的N端添加了细胞穿膜肽，以便于在色素沉着皮肤中的应用时透过皮肤屏障。

附图说明