[发明专利]截短型人刺鼠信号蛋白与穿膜肽的融合蛋白及其制备方法与编码基因

权利要求书

1.一种截短型人刺鼠信号蛋白与穿膜肽的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白是序列表中SEQ ID No:3的氨基酸序列。

2.权利要求1所述的融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括：

(1)制备质粒：人工全基因合成序列表中的SEQ ID No:4的核苷酸序列，对pPIC9K载体及SEQ ID No:4的核苷酸序列进行XhoⅠ和NotⅠ双酶切，回收酶切产物，用DNA连接酶连接，并转化大肠杆菌，提取质粒；

(2)转化：将步骤(1)制备的质粒转化毕赤酵母感受态细胞，获得转化后菌落；

(3)多拷贝插入重组子的筛选：将步骤(2)转化后的菌落进行进一步筛选，获得转化子；

(4)发酵：对步骤(3)获得的转化子进行发酵培养获得发酵液；

(5)纯化：将步骤(4)得到的发酵液依次进行固液分离、过滤、浓缩和离子交换层析得到产品。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)的纯化的具体步骤为：将步骤(4)得到的发酵液经离心进行固液分离，取上清液，对发酵上清液进行微滤，收集滤液，再进行超滤脱盐浓缩，收集浓缩液，然后进行离子交换层析，即可得到产品。

4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，包括：

(1)制备质粒

人工全基因合成序列表中的SEQ ID No:4的核苷酸序列，然后对pPIC9K载体及人工全基因合成的SEQ ID No:4的核苷酸序列进行XhoⅠ和NotⅠ双酶切，回收酶切产物，用DNA连接酶连接，并转化大肠杆菌，提取质粒，命名为pPIC9K-YARA-ASIP₅₀；

(2)毕赤酵母电转化

将经SalⅠ内切酶线性化的pPIC9K-YARA-ASIP₅₀质粒，与毕赤酵母感受态细胞混匀，转至冰预冷的电转化杯中，电击4～10毫秒，加入冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，涂布MD培养基平板，倒置培养3～4天，在MD培养基平板上长出菌落；

(3)多拷贝插入重组子的筛选

将MD培养基平板上长出的菌落对应接种到G418浓度分别为1g/L、2g/L、3g/L、4g/L的YPD平板上，30℃培养，筛选获得转化子；

(4)发酵

将筛选到的转化子接种于BMGY培养基中，振荡培养24小时，作为一级种子转接于装有FBS培养基的发酵罐中，pH值为5.0培养16～20小时，作为二级种子转接入装有FBS培养基的大罐发酵，生长温度30℃，诱导温度低于生长温度，pH值为5.5，溶氧控制在30％，诱导发酵36～42小时；

(5)纯化

将步骤(4)得到的发酵液经离心进行固液分离，取上清液，用孔径为0.22μm中空纤维微滤系统对发酵上清液进行微滤，收集滤液，用截留分子量为1000D的中空纤维超滤系统进行超滤脱盐浓缩，收集浓缩液，采用SP Sepharose FF进行离子交换层析，即可得到产品。

5.权利要求1所述的融合蛋白的编码基因。

6.根据权利要求5所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因是序列表中SEQ ID No:5的核苷酸序列。

7.含有权利要求5或6所述的编码基因的表达载体。

8.含有权利要求5或6所述的编码基因的细胞系。

9.权利要求1所述的融合蛋白在制备药品中的应用。

10.权利要求1所述的融合蛋白在制备化妆品中的应用。