[发明专利]与水稻红褐色颖壳性状有关的sgRNA、CRISPR/Cas9载体、载体构建、应用

说明书

本发明公开与水稻红褐色颖壳性状有关的sgRNA、CRISPRCas9载体、载体构建、应用，克服需要在OsCHI两个等位基因都突变才得到褐壳水稻的缺陷。本发明：提供sgRNA片段，包含特异性靶向水稻肉桂醇脱氢酶CAD基因第五个外显子的gRNA。该sgRNA具体是T1、T2、T3。提供包含上述sgRNA片段的CRISPR/Cas9基因编辑载体及其构建方法，该载体可编辑水稻肉桂醇脱氢酶CAD基因。提供这些片段与载体在获得具有红褐色颖壳和茎结性状水稻材料中的应用。提供用于检测CRISPR/Cas9‑CAD基因重组的引物序列。本发明可降低传统育种成本，提高杂交水稻制种机械化水平，缩短育种周期。

技术领域

本发明涉及与红褐色颖壳性状水稻有关的一种sgRNA片段、 CRISPR/Cas9编辑载体、载体构建方法，及应用。属于基因工程领域。

背景技术

利用自然突变和人工突变，水稻种质资源中能够获得少量不同颖壳颜色的育种材料。借助颖壳的不同颜色可以在水稻机械化制种中将不育系上结的杂种与一同用收割机收获的恢复系种子准确地分开，因而不同颖壳颜色在杂交水稻制种中具有很高的技术价值。但是如果利用传统常规杂交、回交的方法将壳色性状转育到恢复系、保持系且不改变原有材料的特性，需要近十年的时间才能实现。

授权公告号为CN 104017821 B的中国发明专利公开了一种定向编辑颖壳颜色决定基因OsCHI创制褐壳水稻材料的方法。该方法主要内容包括在颖壳颜色决定基因OsCHI外显子区选取靶标片段并构建植物 CRISPR/Cas9打靶重组载体，将该重组载体导入水稻细胞并再生成苗，在载体中的表达框的作用下对水稻细胞进行剪切，触发水稻细胞DNA 的自我修复功能。再通过对再生株系基因组目标片段的测序，获取携带两个等位OsCHI基因同时发生功能缺失突变的株系，经过颖壳颜色鉴定，即为所创制的褐壳水稻材料。该方法不足之处在于：需要在OsCHI两个等位基因都突变才能产生褐壳水稻，同时对两个基因进行突变的效率较低，难以获得两个基因突变的纯合突变体。

发明内容

本发明的目的就是针对现有技术的不足，提供一种可以快速获得红褐色颖壳性状水稻材料的技术方案。

为实现上述目的，本发明首先提供一种sgRNA片段，该sgRNA片段能够针对同一基因进行编辑，其技术方案如下：

一种sgRNA片段，其特征在于：包含特异性靶向水稻肉桂醇脱氢酶 CAD基因的第五个外显子的gRNA。

上述sgRNA片段包含的gRNA特异性靶向于水稻肉桂醇脱氢酶 CAD基因(Oryzasativa(indica cultivar-group)cinnamyl-alcohol dehydrogenase(CAD)gene，GenBank:DQ234272.1)的第五个外显子，碱基序列如SEQ ID NO.6。

上述sgRNA片段，包括三个sgRNA片段，分别是：命名为T1的 sgRNA片段，碱基序列如SEQ ID NO.1；命名为T2的sgRNA片段，碱基序列如SEQ ID NO.2；命名为T3的sgRNA片段，碱基序列如SEQ ID NO.3。

上述三个sgRNA片段是选择水稻肉桂醇脱氢酶CAD基因(Oryza sativa(japonicacultivar-group)cinnamyl alcohol dehydrogenase(CAD)gene) 上的三个sgRNA靶向位点，参考http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR靶位点预测而设计，用http://www.rgenome.net/cas-offinder/网址分析脱靶效应，最终选择确定。

上述sgRNA片段可用于制备水稻肉桂醇脱氢酶基因CRISPR/Cas9 基因编辑载体。本发明进一步提供技术方案：上述sgRNA在制备水稻肉桂醇脱氢酶基因CRISPR/Cas9基因编辑载体中的应用。