[发明专利]与水稻红褐色颖壳性状有关的sgRNA、CRISPR/Cas9载体、载体构建、应用

权利要求书

1.sgRNA片段，其特征在于：包含特异性靶向水稻肉桂醇脱氢酶CAD基因的第五个外显子的gRNA。

2.根据权利要求1所述的sgRNA片段，其特征在于：包括命名为T1、碱基序列如SEQ IDNO.1的sgRNA，命名为T2、碱基序列如SEQ ID NO.2的sgRNA，命名为T3、碱基序列如SEQ IDNO.3的sgRNA。

3.包含权利要求2所述的sgRNA片段的CRISPR/Cas9基因编辑载体。

4.根据权利要求3所述的CRISPR/Cas9基因编辑载体，其特征在于：包括由OsU6a启动子调控T1 sgRNA片段表达的表达框OsU6a::T1、由OsU6b启动子调控T2 sgRNA片段表达的表达框OsU6b::T2、由OsU6c启动子调控T3 sgRNA片段表达的表达框OsU6c::T3、由玉米泛素Ubiqutin启动子调控Cas9表达的表达框。

5.权利要求3或4所述的CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建方法，其特征在于：将分别连接OsU6a、OsU6b、OsU6c启动子与Ploy-T终止子的T1、T2、T3通过Bsa I酶连入pYLCRISPR/Cas9Pubi-H质粒，构建得到Pubi::Cas9-OsU6a::T1-OsU6b::T2-OsU6c::T3表达盒，获得pYLCRISPR/Pubi::Cas9-OsU6a::T1-OsU6b::T2-OsU6c::T3编辑基因的最终载体。

6.权利要求3或4所述的CRISPR/Cas9基因编辑载体在特异针对水稻肉桂醇脱氢酶基因进行基因编辑的应用。

7.根据权利要求6所述的应用方法，其特征在于：将构建好的载体转入农杆菌EHA105用于农杆菌介导的水稻日本晴愈伤组织遗传转化，并将愈伤组织诱导培养获得再生植株。

8.权利要求1或2所述的sgRNA片段、权利要求4所述的CRISPR/Cas9基因编辑载体在制备红褐色颖壳性状水稻材料中的应用；所述红褐色颖壳性状水稻材料含有或者不含有SgRNA:Cas9:HPT转基因片段。

9.权利要求1或2所述的sgRNA片段、权利要求4所述的CRISPR/Cas9基因编辑载体在水稻机械制种中的应用。

10.用于检测CRISPR/Cas9-CAD基因重组的引物组合1F、1R，其特征在于，1F、1R碱基序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示。