[发明专利]一种C2C12成肌细胞分化培养的培养基

说明书

技术领域

本发明属于成肌细胞的分化培养，涉及一种C2C12成肌细胞分化培养的培 养基。

背景技术

C2C12是小鼠的成肌细胞，分化比较快，可形成具有收缩性的肌管，产生 特征性的肌蛋白。因此，在各种医学研究中应用广泛，如生物医学、肌肉再生 的临床研究等。成肌细胞分化的研究对理解肌肉细胞发育和修复(再生)是 非常重要的。培养中的成肌细胞可以表现出肌肉发生过程的特征，包括增殖， 迁移，融合，肌管形成和收缩。生长于含有10％胎牛血清培养基中的肌肉细 胞即使汇合了，也继续增殖；而当它们生长于含2-5％马血清的培养基中时， 却发生融合并形成肌管。小鼠细胞系C2C12是广泛用来研究成肌细胞增殖和分 化的细胞系。目前的科研要求研究者从实验动物中分离和培养原代的成肌细 胞。在研究中发现，采用Rando描述的方法来分离和分化新生小鼠的成肌细胞 非常困难，成功率低。随着实验步骤的增加，得到的成肌细胞越来越少，过程 中丢失了很多成肌细胞和卫星细胞，卫星细胞是成肌细胞分化所必需的，并且 是成肌细胞的来源；少数存活下来的成肌细胞生长及其缓慢，非常容易发生凋 亡。

申请公布号CN103881966A，发明名称：小鼠成肌细胞的制备方法及其应用， 一种小鼠成肌细胞的制备方法，该方法包括下列步骤：A)将刚离体、并剪碎 的小鼠腿部肌肉按体积比1：2加入分散剂，在37℃颠倒摇动5-10min，1000rpm 离心5min，去上清，得组织碎片；B)组织碎片中按体积比1：2加入分散 剂，在37℃上下颠倒摇动5-10min成浆糊状，按体积比1：10加入血清以终 止酶消化；C)过滤80μm无菌尼龙网，去除大的组织碎片，滤液1000rpm离 心5min，去上清，得沉淀；D)沉淀置胶原蛋白包被的培养皿中，加原代成肌 细胞生长培养基，在37℃，5％CO2的培养箱中培养；E)当成肌细胞生长到 40-80％丰度时，去生长培养基，加分化培养基，每天更换分化培养基持续培养 成肌细胞，直至肌管被诱导形成。该方法能够分离到较多、较纯的小鼠成肌细 胞和卫星细胞，从每克小鼠肌肉中能分离，到约1×10⁸个细胞，其中成肌细胞 和卫星细胞的比例达到90％以上。分离到的细胞生长旺盛，能够在马血清的诱 导下分化形成大量典型的肌管，数量是其它方法形成肌管的10倍以上。但是该 方法分离得到的成肌细胞为原代成肌细胞，分离小鼠骨骼肌成肌细胞并传代超 过5次后，在2％马血清中将其诱导分化三天，只能形成少量的肌管。因此现 有方法分离得到的原代成肌细胞传代4-5次以后，成肌细胞会丧失在体外形成肌 管的能力，成肌细胞的增值和分化能力就会严重降低，采用上述方法分离的细 胞没有办法长期传代保存利用。

发明内容

本发明提供了一种C2C12成肌细胞分化培养的培养基，采用优化生长培养 基和分化培养基的方法，使得实验室分离得到的原代C2C12成肌细胞可以多次 传代培养，并且其增殖分化能力没有明显降低。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种C2C12成肌细胞分化培养的培养基，包括以下步骤：

(1)取传代五次以上的C2C12成肌细胞接种于含有生长培养基的培养瓶 中，置于CO₂孵箱中培养，孵箱条件为占体积分数95％空气，5％CO₂，温度为 37℃，每48h换液，细胞形态观察使用倒置显微镜；

(2)当细胞生长到对数期时，弃去旧培养基，用PBS将细胞洗涤2次， 再加入1m L0.25％胰蛋白酶-EDTA，覆盖细胞，在倒置显微镜下可观察到细胞 消化的情况，当细胞将要分离呈现圆形时，吸去胰酶终止消化，轻拍培养瓶使 细胞自瓶壁脱落，加入3m L生长培养基，用吸管轻轻吹打数次以打散细胞团块， 吸出细胞悬液，放入10m L离心管中，1000r/min离心5min，吸掉上清液，加入 适量新鲜生长培养基，用吸管吹打均匀后，按4000个/cm²铺于含有生长培养基 的孔板内，置于CO₂孵箱内，占体积分数95％空气，5％CO₂，温度为37℃， 每48h换液，细胞形态观察使用倒置显微镜；

(3)待细胞生长至80％汇合时，撤出生长培养基，加入分化培养基中诱导 其进行肌向分化，每48h更换分化培养液，观察细胞形态使用倒置显微镜；

所述的生长培养基为以高糖DMEM培养基为基液，含有10％胎牛血清， 1％双抗，牛蒡子苷8-10μg/升，EGF0.2-0.3mg/L，胰岛素100-200mg/L，地黄多 糖30-50mg/L；