[发明专利]基于Cpf1的植物基因组定点编辑方法

说明书

本发明提供了基于Cpf1的植物基因组定点编辑方法。具体地，本发明提供了基于Cpf1(AsCpf1、FnCpf1、LbCpf1)的植物基因组定点编辑的核酸构建物，载体或载体组合，以及植物基因组定点编辑方法。具体地，所述的核酸构建物包括第一表达盒和任选的第二表达盒，所述的第一表达盒为Cpf1‑NLS融合蛋白表达盒，所述的第二表达盒为crRNA表达盒。利用本发明的方法,可以在预定的植物基因组位点，简便而高效地进行单基因敲除、多基因敲除或者同源重组和外源片段的定向插入。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地涉及RNA引导的植物基因组定点编辑方法。

背景技术

近年来，随着基因定向编辑工具如锌指蛋白核糖核酸酶(Zinc finger nulease，ZFN)、转录激活样效应因子核酸酶(Transcription activator-like effectors nulease，TALEN)和规律成簇间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats，CRISPR)系统的推广应用，特别是CRISPR-Cas9系统由于活性高，特异性好而且构建方便，近三年来发展非常迅速，并且在大量物种上得到成功应用(Li etal.,2012；Sun et al.,2012；Zhang et al.,2012；Dang et al.,2013；Feng et al.,2013；Li et al.,2013；Shan et al.,2013)。然而CRISPR-Cas9系统亦有其局限性：1、CRISPR是一段被一种短重复序列分隔的核酸序列，它们转录形成的CRISPR RNA(crRNA)与另一种返式作用型crRNA(trans-activating crRNA,tracrRNA)部分区域配对形成二元复合体，然后该二元复合体一起引导具有非特异核酸酶活性的Cas蛋白切割与crRNA匹配的DNA序列，所以工程化的CRISPR-Cas9系统也需要将crRNA与tracrRNA融合在一起形成单一的chimericRNA(chiRNA)，并且需要在宿主RNA酶的帮助下才能发挥作用。2、需要序列为NGG的PAM(protospacer-adjacent motif)，这就制造了序列限制，对于富含AT的序列不好编辑。3、Cas9剪切基因组形成的是平末端，方便实现基因敲除但不利于外源基因的定向插入。

2015年，科学家发现并改造出Cpf1(CRISPR from Prevotella and Francisella1)系统，以Fn Cpf1(Francisella novicida U112 Cpf1)为例，研究表明该系统能克服CRISPR-Cas9的上述局限，进一步通过评估来自16种不同细菌的Cpf1酶，最终发现有2种Cpf1蛋白：AsCpf1(Acidaminococcus sp.BV3L6 Cpf1)和LbCpf1(Lachnospiraceaebacterium ND2006 Cpf1)，能够在体内定向剪切人类DNA(Zetsche et al.,2015)。Cpf1蛋白兼具DNA剪切酶和RNA修剪酶的功能，不但能靶向切割DNA双链，而且能把相应的非成熟型crRNA(pre-crRNA)加工剪切成成熟型crRNA(Fonfara et al.,2016)。目前AsCpf1和LbCpf1系统已经在人类细胞和动物细胞上得到应用(Kim et al.,2016a；Kim et al.,2016b；Tóthet al.,2016)。尽管LbCpf1系统亦已报道在水稻中的应用，但其突变效率并不高，并且需要依赖长链非成熟型直接重复序列(DR)，短链成熟型DR序列却未见产生突变(Xu et al.,2016)。

综上所述，为植物基因工程的需要，丰富植物基因编辑的工具箱并克服CRISPR-Cas9系统的其局限性，本领域迫切需要开发简便而高效的基于Cpf1的植物基因组定点编辑方法。由于成熟型crRNA更加短小，便于人工合成并且更加容易转化进入细胞，所以开发基于成熟型crRNA的CRISPR-Cpf1系统会更具优势。

发明内容