[发明专利]基于Cpf1的植物基因组定点编辑方法

权利要求书

1.一种用于植物基因组定点编辑的核酸构建物，其特征在于，所述的核酸构建物包括第一表达盒和第二表达盒；

其中，所述的第一表达盒为Cpf1-NLS融合蛋白表达盒，其中所述的Cpf1-NLS融合蛋白具有式I结构：

P1-A-B1-C-B2-D-B3-E1 (I)

式中，

P1为第一启动子；

A为无、信号肽、和/或蛋白标签序列；

B1为无或核定位信号序列NLS；

B2为无或核定位信号序列NLS；

B3为无或核定位信号序列NLS；

附加条件是，B1、B2和B3中至多一个为无；或者B1和B3为无，而B2为核定位信号序列NLS；

C为Cpf1的N端片段元件；

D为Cpf1的C端片段元件；

E1为第一终止子；

其中，所述的N端片段元件和C端片段元件共同构成一个完整的Cpf1蛋白；

以及，所述的第二表达盒为crRNA表达盒，在所述的crRNA表达盒含有对应于成熟型crRNA的编码序列；

所述Cpf1选自下组：FnCpf1 、LbCpf1；

并且所述的第二表达盒具有式II结构crRNA表达盒：

P2-(R-S)q-T (II)

式中，

P2为第二启动子；

各R独立地为对应于成熟型直接重复序列(direct repeat, DR)

各S独立地为目标位点引导序列sg；

q为2-10；

T为无或终止序列。

2.如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述的第一表达盒和第二表达盒分别位于不同的表达载体上。

3.如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述的第一表达盒和第二表达盒位于同一表达载体上。

4.如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述核定位信号序列NLS选自或来自下组：SV40、KRP2、MDM2、CDc25C、DPP9、MTA1、CBP80、AreA、M9、Rev、hTAP、MyRF、EBNA-6、TERT、Tfam、或其组合。

5.如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述的C对应于Cpf1蛋白的第1位至第n位的氨基酸序列，其中n为691-718或615-633的正整数。

6.如权利要求5所述的核酸构建物，其特征在于，n为692-717(FnCpf1)或616-632(LbCpf1)中任一正整数。

7.如权利要求5所述的核酸构建物，其特征在于，n为709(FnCpf1)或627(LbCpf1)。

8.如权利要求5所述的核酸构建物，其特征在于，所述的D对应于Cpf1蛋白的第n+1位至第m位的序列，其中n如上定义，m为全长Cpf1的最后一个氨基酸的位置编号。

9.如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述B2位于Cpf1多肽的非保守区。

10.如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述终止序列选自下组：polyT、NOS、polyA或其组合。

11.如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述的第二表达盒为具有式III或IV结构crRNA表达盒：

P2-R-S-R-T (III)

P2-(R-S)_q-R-T （IV）。

12.如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，各S为sg序列。

13.如权利要求12所述的核酸构建物，其特征在于，所述的sg序列的长度为17-35nt。