[发明专利]一种增加CHO细胞群蛋白表达量的方法

说明书

本发明公开一种增加CHO细胞群蛋白表达量的方法，其利用shRNA技术控制乳酸代谢通路上关键酶的转录，具体步骤包括：1)构建含有待表达蛋白序列的质粒和含有表达乳酸代谢通路上关键酶的shRNA的质粒；2)将步骤1)中构建的质粒通过转染的方法引入CHO细胞中；3)对步骤2)中转染后细胞进行抗生素筛选；4)待细胞状态恢复后，采用步骤3)筛选后的细胞生产目标蛋白；所述表达乳酸代谢通路上关键酶包括乳酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶激酶。本发明所提供的方法与传统CHO细胞群生产中需要对pH进行密切监测并不断通过加入碱来调节相比，此发明仅仅在转染时同时额外共同转染数个shRNA质粒，不但操作复杂程度大幅降低，而且对乳酸降低进而最终蛋白产量提高有较大的保障。

技术领域

本发明涉及生物制药领域，特别是涉及采用CHO(Chinese Hamster Ovary，中国仓鼠卵巢细胞)细胞表达蛋白的方法。

背景技术

随着制药行业的蓬勃发展，大规模CHO细胞蛋白生产的需求日益增加。细胞群批次补料可以在较短时间内提供克级以上蛋白用于研发等用途，因此其应用越来越广泛。批次补料过程中，各种代谢废物也在培养体系中不断堆积，造成细胞周围环境逐渐恶化，细胞活率降低，导致细胞蛋白比生产率降低，直接影响蛋白最终产量。

乳酸作为一种主要代谢副产物，对细胞培养体系pH有显著影响。过多的乳酸堆积会造成整个体系pH大幅降低进而影响细胞蛋白表达。在生物反应器中，pH通常可以通过在线监测并添加碱来得到有效的控制，然而过多碱的添加会造成培养体系渗透压的增加，同样不利于细胞蛋白表达。对于更加常见的摇瓶表达，pH无法实时监控，乳酸堆积对蛋白表达的影响更加显著。通过工艺的精细控制有时可以缓解乳酸堆积现象，然而需要耗费较多的人力物力。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，提供一种增加CHO细胞群蛋白表达量的方法，其能够有效降低蛋白表达过程中乳酸堆积现象，无需通过监控pH和添加碱来控制代谢副产物乳酸的量，减少蛋白生产过程中的pH监控和调节操作，降低人力物力。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：一种增加CHO细胞群蛋白表达量的方法，其是利用shRNA技术控制乳酸代谢通路上关键酶的转录，从而达到降低乳酸量来提高目标蛋白表达量；

具体步骤包括：

1)构建含有待表达蛋白序列的质粒和含有表达乳酸代谢通路上关键酶的shRNA的质粒；

2)将步骤1)中构建的质粒通过转染的方法引入CHO细胞中；

3)对步骤2)中转染后细胞进行抗生素筛选；

4)待细胞状态恢复后，采用步骤3)筛选后的细胞生产目标蛋白。

在哺乳动物细胞中，许多因素会影响乳酸的代谢，比如培养基中三羧酸循环中和乳酸代谢相关产物的浓度，如糖和丙酮酸盐的浓度。本发明中所述乳酸代谢通路上关键酶包括乳酸脱氢酶；乳酸脱氢酶(LDH)催化丙酮酸盐转化为乳酸，控制乳酸脱氢酶的表达可以直接或者间接降低乳酸的代谢。本发明中所述乳酸代谢通路上关键酶包括丙酮酸脱氢酶激酶；丙酮酸脱氢酶可将乳酸转化为乙酰辅酶A，而其活性可被丙酮酸脱氢酶激酶(PDK)抑制，控制丙酮酸脱氢酶激酶的表达也可以直接或者间接降低乳酸的代谢。

本发明中提供的技术方案包括通过抑制乳酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶激酶中的至少一种从而达到降低乳酸的效果。

所述步骤1)中，含有表达乳酸代谢通路上关键酶的shRNA的质粒是将表达乳酸代谢通路上关键酶所对应的shRNA序列以及相应的启动子等转录原件构建至质粒上。优选的，该质粒还包含抗生素基因用于筛选。可将目的蛋白基因序列构建至其他含有抗生素基因的质粒上，得到含有待表达蛋白序列的质粒。

较佳的，所述步骤1)中，使用去内毒素的质粒抽提试剂盒提取质粒DNA。