[发明专利]一种纯化蛋白的方法以及试剂盒

说明书

本发明属于生物化学和发酵工程领域，涉及一种纯化蛋白的方法以及试剂盒。具体地，所述纯化蛋白的方法，包括将蛋白包涵体的复性产物进行层析的步骤。本发明的方法纯化蛋白的复性率高，收率高，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明属于生物化学和发酵工程领域，涉及一种纯化蛋白的方法以及试剂盒。具体地，所述蛋白为血小板生成素模拟肽或其融合蛋白。

背景技术

特发性血小板减少性紫癜(ITP)是一种常见的出血性疾病，其患者有很大的出血风险。2008年8月，美国FDA批准罗米司亭(含有血小板生成素模拟肽)上市，用于治疗特发性血小板减少性紫癜。罗米司亭产生自大肠埃希杆菌，系利用重组DNA技术制成的能刺激血小板生成的Fc肽融合蛋白，包含2个相同的单链亚单元，每个单链包含IgG Fc区和血小板生成素(thrombopoietin，TPO)模拟肽，分子量约为59kDa，其中Fc段可有效延长药物半衰期，而血小板生成素模拟肽可与巨核祖细胞上的血小板生成素受体结合，使其活化，经由细胞内信号传导促进血小板生成。由于该药物同TPO无同源性，不产生抗体，耐受性好，且药效显著，被广泛用于ITP患者。罗米司亭的结构式如下面的式A所示，其中TMP表示血小板生成素模拟肽IEGPTLRQWLAARA(SEQ ID NO:1)。

该血小板生成素模拟肽多为原核发酵以包涵体的形式表达，需要经过变复性等复杂工艺制备，工艺大致为菌体破碎、包涵体洗涤、变性、复性、层析纯化。现有生产工艺由于复性率低，且相关杂质去除率低，导致生产成本高、产品纯度低，不适宜工业化生产。例如中国专利公开CN102321168报道了一种制备血小板生成素模拟肽的方法，包含以下步骤：将含有血小板生成素模拟肽基因的大肠杆菌工程菌高密度发酵后，将菌体超声破碎，尿素裂解，复性，调pH，经过亲和层析、阳离子层析、分子筛层析三步层析得到血小板生成素模拟肽。其复性率为30％－40％，纯化收率为每升发酵液可得血小板生成素模拟肽300mg。

然而，该方法存在复性率低(30％－40％)，收率低(每升仅得到成品300mg)的缺点。另外，该工艺采用分子筛层析来去除小分子，但分子筛层析对装柱高度和柱效以及上样量要求严格，多在实验室阶段使用，并不适于工业生产。另外当蛋白电荷变异超过一个pH单位时，会影响药物的组织分布及药代动力学，因此仍需提高纯度，改善其组织分布及药代动力学。

因此，尚需要开发新的针对血小板生成素模拟肽的蛋白纯化工艺。

发明内容

本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，得到了一种纯化血小板生成素模拟肽或其融合蛋白的方法。本发明人惊奇地发现，在血小板生成素模拟肽或其融合蛋白包涵体的复性产物的层析处理中，当采用羟基磷灰石层析(特别是不采用分子筛层析)时，得到的蛋白的收获量显著提高，蛋白的活性和纯度亦非常高。进一步地，本发明还优化了蛋白包涵体复性之前的预处理工艺，显著地提高了复性率。由此提供了下述发明：

本发明的一个方面涉及一种纯化蛋白的方法，包括将蛋白包涵体的复性产物进行层析的步骤，其中，

所述蛋白为血小板生成素模拟肽或其融合蛋白，其中，所述融合蛋白含有一个或多个血小板生成素模拟肽；优选地，所述融合蛋白包含2、3、4、5或6个血小板生成素模拟肽；

所述层析包括羟基磷灰石层析；

其中，所述血小板生成素模拟肽长度为9－16个氨基酸(例如9、10、11、12、13、14、15或16个氨基酸)，并且包含下面的式I所示的肽段：

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9

式I

其中，

X1选自谷氨酸、天门冬氨酸、赖氨酸和缬氨酸；

X2选自甘氨酸和丙氨酸；

X3选自脯氨酸；