[发明专利]一种纯化蛋白的方法以及试剂盒

权利要求书

1.一种纯化蛋白的方法，包括将蛋白包涵体的复性产物进行层析的步骤，其中，

所述蛋白为血小板生成素模拟肽融合蛋白；所述融合蛋白为血小板生成素模拟肽与人IgG Fc的融合蛋白；所述人IgG Fc的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；

所述蛋白如下面的式II所示：

其中，

TMP表示血小板生成素模拟肽，其氨基酸序列如SEQ ID NOs:1－4中任一序列所示；所述层析为亲和层析、阴离子层析和羟基磷灰石层析，所述层析不包括分子筛层析和/或阳离子层析；

所述层析的步骤为将蛋白的复性产物依次进行亲和层析、阴离子层析和羟基磷灰石层析；

其中，所述亲和层析使用选自如下的亲和层析柱：

Mabselect或Mabselect sure；

所述阴离子层析使用如下的阴离子层析柱：

Q Sepharose HP；

所述羟基磷灰石层析选用I型陶瓷羟基磷灰石；

所述蛋白复性液包括40－60mM Tris，40－400mM Arg，1－5mM氧化还原对，0.5－2mMEDTA，1－2M尿素的溶液，pH为7.0－9.0；

所述纯化方法还包括在蛋白复性之前，将蛋白包涵体的变性产物进行透析或超滤的步骤；

所述透析或超滤的截留分子量范围是5－20kD；

所用透析液的pH为2.5－3.5；

以及透析时间为10－40小时；

所述纯化方法还包括在所述透析或超滤之后，将透析截留产物或超滤截留产物进行氧化生成二硫键的步骤；其中，通过加入选自胱胺、氧化性谷胱甘肽和胱氨酸的任意一种或者几种进行氧化生成二硫键。

2.根据权利要求1所述的纯化方法，其中，所述透析或超滤的截留分子量范围是8－15kD。

3.根据权利要求1所述的纯化方法，其中，所述透析液的pH为2.7－3.2。

4.根据权利要求1所述的纯化方法，其中，所述透析液为HCl溶液。

5.根据权利要求1所述的纯化方法，其中，所述透析时间为15-30小时。

6.根据权利要求1～5任意一项所述的纯化方法，其中，所述羟基磷灰石层析包括下述步骤：

a)用平衡缓冲液平衡羟基磷灰石层析柱；

b)将含有目的蛋白的样品上样；

c)用洗脱缓冲液进行梯度洗脱。

7.根据权利要求6所述的纯化方法，其中，所述步骤a)中的平衡缓冲液为磷酸缓冲液。

8.根据权利要求6所述的纯化方法，其中，所述步骤c)中的洗脱缓冲液为含有NaCl的磷酸缓冲液。

9.根据权利要求6所述的纯化方法，其特征在于如下的(1)－(4)项中的任意一项或者多项：

(1)步骤a)中，所述平衡缓冲液为pH为6.0－7.0的10－20mM磷酸缓冲液；

(2)步骤b)中，上样量为5－20mg蛋白/ml填料；

(3)步骤c)中，所述洗脱缓冲液为pH为6.0－7.0的含0.5－1.5MNaCl的10－20mM磷酸缓冲液；

(4)步骤c)中，洗脱体积为10－25倍柱体积，收集第二个洗脱峰。

10.一种制备蛋白的方法，其包括权利要求1至9中任一权利要求所述的纯化方法。