[发明专利]一种三氯杀螨醇半抗原制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种三氯杀螨醇半抗原制备方法及其应用，例如在时间分辨荧光试纸条和胶体金免疫层析试纸条中的应用，属于快速检测技术领域，用于茶叶、白菜、大米、植物油、鱼肉、虾肉等样品中三氯杀螨醇的含量检测。

背景技术

三氯杀螨醇是一种低毒杀螨剂，不溶于水，可溶于多种有机溶剂。在酸性溶液中稳定，碱性介质中容易分解。我国主要在柑橘、苹果、梨及棉花上准许使用。由于其原料来自DDT，因此，三氯杀螨醇的工业品都可能含有一定量的DDT，这会导致使用该药剂的农产品的残留量明显增高。因此，我国目前禁止在茶树及蔬菜上使用。除此之外，水产品中也被检出该药物超标，国家质量监督检验检疫总局要求加强对三氯杀螨醇的监控。GB 2763-2014《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》中规定三氯杀螨醇在棉籽油的最大残留限量为0.5mg/kg，水果(柑橘、橙、柚、柠檬、苹果、梨)的最大残留限量为1mg/kg。

目前，检查该药物的方法主要是质谱法等仪器方法，仪器检测方法的精确度较高，但是仪器昂贵，需要专业的技术人员，检测步骤复杂，难以批量检测样品，不适用于基层实验室批量、快速检测样品。而免疫学检测方法操作简单、快速、灵敏，可同时检测多数样品，是理想的快速筛选手段。

发明内容

本发明的目的是提供一种三氯杀螨醇半抗原制备方法，以及它在时间分辨荧光试纸条和胶体金免疫层析试纸条(简称“胶体金试纸条”)中的应用。

本发明所提供了一种检测三氯杀螨醇的时间分辨荧光试纸条，该试纸条包括样品吸收垫、反应膜以及吸水垫三部分。反应膜位于中间，样品吸收垫与吸水垫分别搭接于反应膜左右两端。其中，样品吸收垫上设有加样区和微球区，微球区上载有时间分辨荧光微球；反应膜上设有检测线(T线)和质控线(C线)，T线接上包被三氯杀螨醇抗原，C线包被抗兔抗体。

所述三氯杀螨醇时间分辨荧光微球，包括检测微球和质控微球，检测微球为表面包被有三氯杀螨醇单克隆抗体的荧光微球，质控微球为表面包被有兔抗标记蛋白的荧光微球。

所述荧光微球中填充了斓系元素化合物；较优的，该斓系元索鳌合物为铕鳌合物；最优的，该铕鳌合物可为Eu(TTA)3/TOPO或Eu(TTA)3/Phen。

所述蛋白可以是牛血清Y-球蛋白(BGG)或小牛血清白蛋白(BSA)。

所述时间分辨荧光微球粒径范围为100-1000nn。

所述硝酸纤维素膜上，T线上包被的抗体为三氯杀螨醇抗原，C线上包被的抗兔抗体。

所述三氯杀螨醇时间分辨荧光免疫定量检测试纸条底部设有塑料底板。

所述T线接上包被三氯杀螨醇抗原是由三氯杀螨醇半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白。

所述三氯杀螨醇单克隆抗体是以三氯杀螨醇半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得，是由三氯杀螨醇单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌获得；所述抗兔抗体是将兔源抗体免疫羊得到。

所述样品吸收垫为Fusion5膜或其他功能相同的膜；所述结合物释放垫可为玻璃棉或聚酯材料；所述吸水垫为吸水垫；所述反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。

本发明的另一个目的是提供一种制备上述试纸条的方法，其包括步骤：

(1)质控微球制备：

①用生物素标记蛋白；

②采用上述标记蛋白包被醛基修饰的荧光微球；

(2)半抗原制备：经过一系列化学反应得到三氯杀螨醇半抗原产物；

(3)将三氯杀螨醇半抗原与载体蛋白偶联，得到三氯杀螨醇半抗原-载体蛋白偶联物；

(4)用三氯杀螨醇半抗原-载体蛋白偶联物免疫新西兰大白兔，将新西兰大白兔脾细胞和骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到三氯杀螨醇单克隆杂交瘤细胞株；

(5)提取新西兰大白兔IgG免疫健康山羊，得到抗兔抗体；

(6)检测微球制备：采用三氯杀螨醇的单克隆抗体包被醛基修饰的荧光微球；

(7)空白大卡粘贴：将硝酸纤维素膜粘贴在塑料底板中间，Fusion5膜与吸水垫分别搭接于硝酸纤维素膜左右两端；

(8)喷膜：将兔抗标记蛋白的荧光微球和三氯杀螨醇单克隆抗体的荧光微球采用释放缓冲液混合稀释到一定浓度，喷到Fusion5膜的微球区；三氯杀螨醇抗原和抗兔抗体稀释后，分别喷到硝酸纤维素膜的T线和C线位置；

(9)干燥及切条：将上述喷好试剂的大卡烘干、切条。